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缺氧微环境中HIF-1α诱导MT2-MMP表达及对胰腺癌侵袭和转移作用的机制研究

朱世凯  
【摘要】: 第一部分 MT2-MMP与HIF-1α在胰腺癌中表达及相关性的探讨 目的:探讨膜型金属蛋白酶-2(MT2-MMP)与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在胰腺癌组织和细胞中表达及相关性。 方法:应用免疫组化法检测78例胰腺癌组织中MT2-MMP和HIF-1α蛋白的表达情况,并分析两者表达的相关性;同时在体外细胞实验中,采用实时定量PCR与Western blot法检测不同缺氧时间对胰腺癌PANC-1细胞MT2-MMP与HIF-1α表达的影响;然后,探讨上调或下调HIF-1α基因表达对胰腺癌PANC-1细胞MT2-MMP蛋白表达的影响。结果:免疫组化结果显示78例胰腺癌组织中MT2-MMP与HIF-1α蛋白阳性表达率分别为57.7%和66.7%。对同一组织标本连续性切片观察发现MT2-MMP与HIF-1α蛋白表达的区域分布有呈明显重叠,进而采用Spearman双变量相关性分析显示胰腺癌组织中MT2-MMP与HIF-1α蛋白表达水平呈高度正相关(r=0.619,P0.001)。体外细胞实验显示胰腺癌PANC-1细胞MT2-MMP mRNA和蛋白的表达水平随着缺氧(1%02)时间延长而不断增加,且具有显著的时间依赖性(P0.05)。其后,我们采用缺氧诱导剂CoCl2或HIF-1α表达质粒上调PANC-1细胞HIF-1α基因的表达,结果发现MT2-MMP蛋白的表达水平随着HIF-1α表达量的增加而上升(P0.05);而利用HIF-1α特异性抑制剂YC-1或HIF-1αsiRNA阻断HIF-1α的表达,MT2-MMP蛋白的表达水平则随着HIF-1α表达量的减少而下降。 结论:MT2-MMP和HIF-1α在胰腺癌组织和细胞中均有不同程度的表达,并且二者表达呈高度正相关。 第二部分 缺氧微环境中HIF-1α对MT2-MMP基因表达调控作用的分子机制 目的:恶性肿瘤的进展需要肿瘤细胞不断适应低氧微环境,该过程主要是由转录因子HIF-1α通过调控缺氧反应基因的表达来实现的。本部分研究将进一步阐明缺氧微环境下转录因子HIF-1α对胰腺癌细胞中MT2-MMP基因表达调控作用的分子机制。方法:我们首先构建MT2-MMP基因启动子全长的报告基因载体,明确HIF-1α是否直接结合于MT2-MMP基因启动子上激活其转录;然后通过构建截短和突变的MT2-MMP基因启动子的报告基因载体,寻找并定位MT2-MMP基因启动子上HIF-1α结合位点;随后分别采用HIF-1α结合/竞争实验和染色质免疫沉淀(ChIP)实验,进一步确认HIF-1α能否在体外和体内直接结合到MT2-MMP基因启动子的HIF-1α结合位点上。 结果:我们将成功构建MT2-MMP基因启动子全长的报告基因载体和pRL-TK质粒共转染PANC-1细胞,结果发现缺氧条件下HIF-1α直接结合于MT2-MMP基因启动子上并启动其转录;然后通过构建截短和突变的MT2-MMP基因启动子的报告基因载体,证实在定位在MT2-MMP启动子上的nt-264 HRE1序列是缺氧诱导MT2-MMP转录激活所必不可少的条件。进一步通过HIF-1α结合/竞争实验和ChIP实验证实HIF-1α在体内体外都能特异性地结合到MT2-MMP基因启动子上的一个功能性HRE1位点上。 结论:缺氧微环境下HIF-1α通过直接与MT2-MMP基因启动子的功能性HRE1位点结合,激活MT2-MMP基因的转录,这发现揭示了一个调控肿瘤细胞MT2-MMP基因表达的新机制。 第三部分 调控MT2-MMP基因表达对胰腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭作用的影响 目的:通过利用特异性MT2-MMP干扰质粒或过表达质粒调控MT2-MMP基因表达,探讨其表达对胰腺癌PANC-1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。 方法:构建靶向沉默MT2-MMP siRNA干扰质粒和MT2-MMP过表达真核表达质粒,通过脂质体转染法稳转至人胰腺癌PANC-1细胞株。通过采用实时定量PCR和Western blot法验证PANC-1细胞中MT2-MMP基因的表达情况。我们利用CCK-8比色法检测调控MT2-MMP的表达对胰腺癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测胰腺癌细胞的凋亡率变化;Transwell细胞侵袭实验观察对PANC-1细胞侵袭能力的影响。 结果:成功构建pGenesil-MT2-MMP-siRNA干扰质粒和pDNA3.1-His-MT2-MMP表达质粒。经实时定量PCR和Western blot实验证实MT2-MMP过表达组PANC-1细胞MT2-MMP mRNA和蛋白表达水平明显上调,而siRNA稳转组MT2-MMP表达显著下调。研究发现MT2-MMP过表达组PANC-1细胞的增殖能力明显高于比MT2-MMP siRNA组(P005); MT2-MMP过表达组的细胞凋亡率较MT2-MMP siRNA组也有明显增加(P0.05);并且MT2-MMP过表达组穿膜细胞数明显多于MT2-MMP siRNA组,其数值分别216.4±18.6个/视野和75.8±8.2个/视野(P0.05)。 结论:研究发现特异siRNA沉默MT2-MMP基因表达后能抑制缺氧条件下胰腺癌PANC-1细胞增殖和侵袭,并促进细胞凋亡;而上调MT2-MMP基因表达可促进细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,这一发现提示MT2-MMP可能是一个促癌基因,为将来基因靶向治疗胰腺癌提供了新的思路。


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