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《华中科技大学》 2010年
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诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心缺血再灌注损伤和排斥反应的机制研究

张松林  
【摘要】: 第一部分 应用Tail-cuff技术改良小鼠颈部异位心脏移植模型 目的小鼠颈部心脏移植模型是研究移植缺血再灌注损伤和排斥反应的理想模型,由于显微血管吻合的技术问题,限制了其在医学研究中的广泛应用。在本实验室既往应用套管法(cuff technique)建立该模型的基础上,本研究应用Tail-cuff技术(带尾套管法)改良小鼠颈部异位心脏移植模型。方法昆明小鼠用作预实验,C57BL/6和BALB/c小鼠用作正式试验。应用24G和22G静脉内导管制作成带有尾巴的动脉或静脉套管(Tail-cuff),在准备受体血管时,Tail-cuff通过右颈外静脉或右颈总动脉近心端后,用显微血管夹一起固定其近心端和Tail-cuff管的尾巴,翻转血管并固定后分别与供心的肺动脉主干和升主动脉连接固定。 结果应用这种改良技术,预实验手术成功率为72.2%(13/18),总操作时间为56.2±8.9min。正式实验总操作时间为49.6±7.4 min,血管翻转和与供心连接时间分别为3.6±1.4min和4.1±1.1 min,正式实验(12例同系移植,24例同种移植)的成功率为100%(36/36)。 结论应用Tail-cuff技术建立小鼠颈部异位心脏移植模型显示出一定的优越性,是一种理想的方法。 第二部分 诱导受体产生一氧化碳减轻小鼠移植心的冷缺血再灌注损伤 目的一氧化碳(carbon monoxide, CO)是血红素加氧酶催化亚铁血红素生成的代谢产物之一,对大鼠肝、肺、肾和小肠的缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, IRI)具有明显的保护作用。本研究在小鼠心脏移植模型的基础上,观察以二氯甲烷(methylene chloride, MC)诱导受体小鼠产生CO对移植心冷IRI的影响,并探讨其可能的机制。 方法以Balb/c小鼠作为供、受者,建立颈部异位心脏移植模型。实验共分为4组,分别为MC100mg组(n=10)、MC500mg组(n=12)、橄榄油组(IR组,n=10)和正常对照组(N,n=5)。前3组在麻醉前3 h分别用经橄榄油稀释的MC100mg/kg、MC500mg/kg以及单纯橄榄油0.15ml(IR组)对受者进行灌胃处理,然后行颈部异位心脏移植;N组小鼠仅作麻醉处理,不进行心脏移植。分别于灌胃后0、1、3、6、12和24 h剪尾采血,测定血液中CO的含量[用碳氧血红蛋白(COHb)占总血红蛋白的百分比表示],并于相应时间点取心肌组织,检测心肌组织中CO的含量;各组移植后3h和24 h分别处死半数受者,检测移植后3h和24 h血清中肌钙蛋白I(cTnI)、心肌组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)、细胞凋亡与相关基因Bcl-2和Bax mRNA以及核因子κB(NF-κB)的表达,并观察移植心心肌的超微结构。 结果与橄榄油灌胃比较,以MC100 mg和MC500 mg灌胃受者血液中COHb浓度与心肌组织中CO含量明显升高,均在灌胃后3 h达到峰值(P0.01)。与IR组比较,MC100 mg和MC500 mg组受者心脏移植后3h和24 h,能显著降低血清中cTnI水平(P0.01),并以MC500 mg组降低最为明显;可明显下调促炎症基因TNF-a mRNA水平(P0.01),而抗炎症基因IL-10 mRNA上调不明显(P0.05),同时可以显著上调抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平(P0.01),并抑制促凋亡基因Bax mRNA的转录(P0.01);心肌超微结构损伤明显减轻,以MC500mg组最为显著。正常对照组可见少量NF-κB表达,而IR组、MC100mg组和MC500 mg组NF-κB活性均显著增强(P0.01),但后三组之间在相同时间点的NF-κB活性无明显区别(P0.05)。 结论诱导受体小鼠产生CO明显减轻小鼠移植心冷IRI,其主要机理与CO的抗炎和抗凋亡作用有关,且不受NF-κB信号转导通路的调节。第三部分 诱导受体产生一氧化碳经PI3K/Akt信号途径抑制冷缺血再灌注诱导的移植心细胞凋亡 目的CO是体内的一种重要信号分子。外源性低浓度的CO具有缓解血管损伤、排斥反应和急性肺损伤等功能,但涉及到的信号机理尚未完全阐明。本研究在小鼠心脏移植的基础上,观察诱导受体产生CO对移植心冷IRI中细胞凋亡的影响,并探讨其可能的信号机制。 方法以Balb/c小鼠建立同系移植心冷IRI模型。受体用二氯甲烷(MC,500mg/kg体重)灌胃诱导受体小鼠产生CO(MC组,n=12),或用橄榄油灌胃(IR组,n=12),在MC组的基础上受体在移植心恢复血供前1h腹腔注射PI3K抑制剂LY294002(40mg/kg,LY组,n=10)或二甲亚砜(DMSO组,n=10);检测移植后3h和24h(每一时间点n=5~6/组)移植心细胞凋亡并计算凋亡指数(AI)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白、Bcl-2与Bax蛋白的表达及Caspase-3蛋白酶活性;设立正常对照组(N组,n=5)。 结果受体以MC灌胃后血液中COHb浓度与心肌组织CO含量均在3h达到峰值,分别为(9.82±0.84)%和2.25±0.08 pmol/mg;与IR组比较,MC组明显降低移植心AI[3h:(8.65±2.01)%vs.(19.28±4.94)%,P0.01;24h:(5.82±2.36)%vs.(10.54±3.66)%,P0.05].激活Akt蛋白(3h:P0.01;24h:P0.05).抑制Caspase-3蛋白酶活性(3h:2.19±0.18 vs.3.31±0.36,P0.05)、上调Bcl.2/Bax比值(3h:1.97±0.16比0.46±0.07,P0.01;24h:1.89±0.10比0.51±0.04,P0.01);而与MC组比较,LY组明显增加AI[3h:(17.95±4.92)%,P0.01:24h:(9.75±3.14)%;P0.01]、抑制Akt蛋白激活(3h:P0.01;24:P0.05)、增强Caspase-3蛋白酶活性(3h:3.27±0.24,P0.05)、下调Bcl.2/Bax比值(3h:0.47±0.06,P0.01;24h:0.52±0.03,P0.01),从而逆转其抗凋亡作用;DMSO组与MC组的各个指标无明显统计学意义(P0.05)。 结论诱导受体产生CO能明显抑制冷缺血再灌注诱导的移植心的细胞凋亡,其机理可能与通过P13K/Akt信号途径对凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的调节有关。 第四部分 诱导受体产生一氧化碳减轻同种移植心排斥反应不依赖于Foxp3表达的上调 目的CO由于具有强大的干扰体内氧运输的特性而通常被认为是一种有害的废弃物。事实上,低浓度的CO通过调节血管张力、抗炎、抗凋亡等作用缓解移植物缺血再灌注损伤。本研究在小鼠心脏移植的基础上,观察诱导受体小鼠产生CO对同种移植排斥反应和移植心存活时间的影响,并探讨其可能的机制。 方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型(C57BL/6→Balb/c小鼠)。受体小鼠自移植前1d至移植后第6d(MC1w组,n=11)或至第13d(MC2w组,n=10)以含二氯甲烷(MC)100mg/kg体重灌胃,或以同体积不含MC的橄榄油灌胃(Tx组,n=6)。观测移植心存活时间,并于移植后6d、10d分别检测受体血清TNF-α、IL-10的含量、心脏移植物和受体脾脏TNF-α、IL-10、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表达、心脏移植物ICAM-1(细胞间粘附分子-1)及Caspase-3蛋白的表达;观察移植后6d、10d或移植物心跳停止时移植心胶原纤维增生程度及组织病理学变化。 结果受体以MC灌胃后血液中COHb浓度在3h达到峰值,为(5.24±0.45)%;受体诱导CO可以明显延长移植心存活时间[Tx:(6.33±0.56)d; MC1w: (12.14±0.87)d, P0.01vs.Tx; MC2w组:(19.38±0.95)d,P0.01vs.Tx and MC1w];降低血清TNF-a的含量(MC1w组:P0.01vs.Tx; MC2w组:P0.01vs.Tx and P0.05 vs. MC1w);抑制心脏移植物和受体脾脏TNF-αmRNA的表达(MC1w组:P0.01vs.Tx; MC2w组:P0.01vs.Tx and MC1w);抑制心脏移植物ICAM-1 (MC1w组及MC2w组:P0.01vs.Tx)及Caspase-3的表达(MC1w组:P0.01vs.Tx; MC2w组:P0.01vs.Tx and MC1w);减轻移植物内胶原纤维增生及淋巴细胞和单核细胞侵润的程度,以MC2w组最为明显;各组血清IL-10含量、心脏移植物和受体脾脏IL-10mRNA、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表达无统计学意义(P0.05)。 结论受体小鼠诱导CO明显减轻同种移植排斥反应并延长移植心的存活时间,其主要机制与可能与CO的抗炎症和抗凋亡功能密切相关,而并不依赖于移植物和受体脾脏内Foxp3表达的上调。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R654.2

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