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《华中科技大学》 2010年
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Visfatin诱导THP-1源性泡沫细胞形成的机制研究

庄世虹  
【摘要】: 背景脂肪因子在动脉粥样硬化斑块内表达,具有调节局部内分泌的作用。visfatin是一种新近发现的脂肪因子,最初是作为前B细胞集落刺激因子和烟酰胺磷酸核糖转移酶被人们认识的。已有研究发现其有类似胰岛素分泌的功能,与动脉粥样硬化的发生密切相关。最近发现visfatin在冠状动脉不稳定斑块和颈动脉斑块中表达明显升高。巨噬细胞中LOX-1、ABCA1和ABCG1通过调节巨噬细胞胆固醇代谢在泡沫细胞形成中有重要的作用。然而,visfatin在动脉粥样硬化中调节THP-I源性泡沫细胞形成的机制尚不清楚。 目的观察visfatin对THP-1源性泡沫细胞中调控胆固醇代谢的关键基因与蛋白(LOX-1、ABCA1和ABCG1)的表达情况,进一步探讨其在动脉粥样硬化形成的作用。 方法THP-1单核细胞给予160nM佛波酯在RPMI-1640液中孵育48h,诱导分化为巨噬细胞后加入人重组visfatin,按照剂量的增加和时间的延长随机分为以下几组:(1)visfatin对THP-1细胞的量效作用,①control组:仅加入100mg/L LDL,②ox-LDL组:仅加入100mg/L ox-LDL,③不同浓度组:分别给予(1×10-7mol/L, 1×10-6mol/L, 2×10-6mol/L,1×10-5mol/L) visfatin后给予含有100mg/L LDL的培养液孵育处理24h;(2) visfatin对THP-1细胞的时效作用,①control组:未加入visfatin和LDL,②不同时间组:给予浓度为2×10-6mol/L visfatin处理后,再给予含有100mg/L LDL的培养液孵育12h、24h和36h。各组细胞运用油红O染色可以观察细胞内脂滴的变化,免疫荧光法观测TRITC标记的单克隆抗体ABCA1和异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体ABCG1荧光变化情况,运用RT-PCR和Western blotting观测各组细胞中LOX-1、ABCA1和ABCG1各自mRNA和蛋白表达的水平。 结果高浓度的visfatin与LDL-同孵育THP-1源性巨噬细胞24h后,细胞浆内的脂滴明显增多,并且随着时间延长,细胞浆内脂滴颗粒明显增多。使用TRITC标记单克隆抗体ABCA1和FITC标记单克隆抗体ABCG1后,随着剂量的增加细胞浆内红色荧光和绿色荧光变暗,并且随着时间的延长,红色荧光和绿色荧光表达逐渐变亮。在LDL处理的THP-1源性巨噬细胞上,visfatin随着浓度的增加上调LOX-1 mRNA和蛋白表达(P0.05)。并且数据显示visfatin通过降低ABCA1/ABCG1的表达来诱导泡沫细胞形成(P0.05)。visfatin对不同时间组巨噬细胞刺激后能够上调LOX-1 mRNA和蛋白的表达水平而促进脂质在巨噬细胞内蓄积(P0.05)。并且与对照组相比,visfatin干预不同时间后细胞中ABCA1/ABCG1表达明显升高(P0.05)。 结论visfatin能够导致THP-1细胞中一些胆固醇关键酶的表达发生改变。因此,我们证实visfatin使巨噬细胞中LOX-1表达水平升高,降低ABCA1/ABCG1表达水平,与泡沫细胞形成相关。 背景过氧化物酶体增殖物活化受体Y(PPARγ)是调控巨噬细胞胆固醇代谢的关键核受体,GW9662是PPARγ的拮抗剂。我们前期研究发现巨噬细胞通过下调PPARγ水平导致胆固醇蓄积促进泡沫细胞形成参与了动脉粥样硬化的发病机制。 目的以THP.1源性巨噬细胞为研究对象,体外观察PPARγ拮抗剂对visfatin调控的THP-1源性细胞中LOX-1、ABCA1和ABCG1表达的作用。 方法无血清的RPMI 1640培养液中加入佛波酯孵育使单核细胞转化为巨噬细胞后,加入不同浓度PPARy拮抗剂GW9662,再加或者不加2×10-6mol/L人重组visfatin孵育24h。不同浓度GW9662对visfatin诱导的THP-1细胞的作用①visfatin组:加入2×10-6mol/L visfatin后给予含有100mg/L LDL的培养液孵育处理24h,②GW9662不同浓度组:分别给予(1μM,5μM,10μM,20μM) GW9662后给予2×10-6mol/L visfatin和100mg/L LDL的培养液孵育后再处理24h,③LDL组:仅加入100mg/L LDL。各组采用油红O染色观察细胞内脂滴的蓄积变化。使用RT-PCR和Western blotting分别检测各组LOX-1、ABCA1和ABCG1 mRNA及其蛋白的表达。 结果巨噬细胞经GW9662处理后胞浆内油红O染色阳性的脂滴明显增多。随着GW9662剂量增加能够上调visfatin处理的THP-1源性巨噬细胞中LOX-1和下调ABCA1/ABCG1 mRNA与蛋白的表达(P0.05)。 结论综上所述,PPARγ拮抗剂GW9662能促进大量的脂质蓄积在泡沫细胞中,提示PPARγ相关机制在调节巨噬细胞脂质平衡中的重要性。PPARγ拮抗剂通过激活LOX-1的水平和抑制ABCA1和ABCG1的表达在visfatin诱导的泡沫细胞形成中发挥作用。 背景丝裂原活化蛋白激酶信号通路通过调控巨噬细胞胆固醇代谢在动脉粥样硬化扮演重要作用。我们前期研究发现visfatin与胰岛素有类似的作用,胰岛素与THP-1源性泡沫细胞形成相关,能激活MAPK通路发挥抗动脉粥样硬化的作用。 目的本研究旨在研究visfatin对MAPK通路中LOX-1、ABCA1和ABCG1的表达情况,探讨p38MAPK拮抗剂(SB203528)、ERK1/2拮抗剂(PD98059)和JNK拮抗剂(SP6001251在体外调节THP-1源性泡沫细胞的作用。我们研究MAPK通路拮抗剂是否在THP-1源性泡沫细胞形成中发挥作用。 方法THP-1源性单核细胞给予160nM佛波酯刺激后,单核细胞分化为巨噬细胞,呈浓度递增分别给予MAPK拮抗剂SB203528、PD98059和SP600125,加或者不加2×10-6mol/L人重组visfatin刺激24h。根据MAPK拮抗剂分为不同干预组:(1)不同浓度SB203528对THP-1细胞的作用,①visfatin组:加入2×10-6mol/L visfatin后给予含有100mg/L LDL的培养液孵育处理24h,②SB203528不同浓度组:分别给予(1μM,5μM,10μM,20μM) SB203528后再加入2×10-6mol/L visfatin和100mg/L LDL的培养液孵育24h,③LDL组:仅加入100mg/L LDL;(2)不同浓度PD98059对THP-1细胞的作用,①visfatin组:加入2×10-6mol/L visfatin后给予含有100mg/L LDL的培养液孵育处理24h,②PD98059不同浓度组:分别给予(5μM, 10μM,20μM,50μM)PD98059后再加入2×10-6mol/L visfatin和100mg/L LDL的培养液孵育24h,③LDL组:仅加入100mg/L LDL;(3)不同浓度SP600125对THP-1细胞的作用,①visfatin组:加入2×10-6mol/L visfatin后给予含有100mg/L LDL的培养液孵育处理24h,②SP600125不同浓度组:分别给予(5μM,10μM,20μM,50μM)SP600125后再加入2×10-6mol/L visfatin和100mg/L LDL的培养液孵育24h,③LDL组:仅加入100mg/LLDL。采用油红O染色观察细胞内脂滴的变化。LOX-1、ABCA1和ABCG1基因和蛋白的表达水平的测定采用RT-PCR和Western blotting法。 结果随着SP600125和PD98059剂量增加,visfatin诱导的巨噬细胞中脂滴逐渐减少。随着SB203528浓度增加细胞内脂质蓄积并无明显改变。随着SP600125浓度逐渐增加,在体外LOX-1表达明显降低,ABCA1/ABCG1表达明显升高(P0.05)。SB203528剂量的改变并不能使调节胆固醇转运的LOX-1、ABCA1和ABCG1水平发生改变(P0.05)。 结论总而言之,visfatin作用于ERK1/2和JNK信号通路的一些关键受体减少胆固醇酯蓄积和促进胆固醇流出。visfatin诱导的LOX-1的表达升高能够被ERK1/2和JNK拮抗剂阻断。visfatin通过阻断JNK通路而明显上调人巨噬细胞ABCA1/ABCG1的表达,但是p38MAPK和ERK1/2拮抗剂却不能改变visfatin诱导的THP-1细胞中ABCA1/ABCG1的表达水平。MAPK拮抗剂通过阻断visfatin的作用来调控胆固醇水平,为动脉粥样硬化提供新的治疗方法。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R543

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【参考文献】
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