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《华中科技大学》 2010年
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大鼠2-AAF/PH模型中库普弗细胞促卵圆细胞扩增及肝脏保护作用的实验研究

项帅  
【摘要】:华中科技大学博士学学位论文 目的观察脂质体包裹氯膦酸二钠剔除大鼠肝脏库普弗细胞的作用,以及剔除后库普弗细胞再生恢复的情况。 方法正常大鼠随机分为实验组和对照组。实验组大鼠给予脂质体包裹的氯膦酸二钠,对照组给予等量生理盐水。RT-PCR检测库普弗细胞受体KCR mRNA的表达情况;尾静脉注射印度墨汁判断库普弗细胞吞噬碳素颗粒的情况;组化检测库普弗细胞标记物ED1和ED2的表达情况。给药后不同时间点处死大鼠,动态观察ED1、ED2阳性细胞数目变化。 结果给药后2天RT-PCR检测不到肝脏库普弗细胞受体mRNA的表达,肝窦内吞噬碳素颗粒的库普弗细胞消失,ED1、ED2阳性细胞基本消失。给药后第8天ED1阳性细胞开始明显增多,至第11天其数目基本恢复正常。ED2阳性细胞至第11天开始增加,但平均每中倍视野仍仅有(4.8±1.7)个细胞,明显少于对照组的(17.7±2.1)个细胞,差异具有统计学意义(P0.01)。 结论静脉单次注射合适剂量的脂质体包裹氯膦酸二钠能在2天内有效剔除肝脏库普弗细胞,剔除效果可持续至少一周时间。成功建立剔除肝脏库普弗细胞的动物模型,为我们后续研究库普弗细胞功能的实验奠定了基础。 目的库普弗细胞可以通过释放多种因子在肝细胞介导的肝再生过程中扮演重要角色。前期研究显示,诱导卵圆细胞增殖的动物模型中也发现库普弗细胞大量存在于门脉区,因此我们推测库普弗细胞在卵圆细胞介导的肝再生中也可能起重要作用。本部分通过建立大鼠2-AAF/PH卵圆细胞介导肝再生模型,观察剔除库普弗细胞后卵圆细胞扩增的变化,旨在探讨库普弗细胞对卵圆细胞增殖扩增的作用。 方法将2-AAF/PH卵圆细胞增殖模型大鼠随机分为库普弗细胞剔除组和非剔除对照组。术前48小时剔除库普弗细胞,对照组给予等剂量生理盐水,术后不同时间点处死大鼠。计算残肝重量/体重比值评估残肝再生程度;免疫组化检测EpCAM、PCK和PCNA并计数阳性细胞数目,计算门脉区周围嗜碱性新生小管样反应面积,以评估卵圆细胞增殖程度;免疫荧光双标检测EpCAM和PCNA共表达情况检测卵圆细胞增殖率;Caspase-3组化和TUNEL染色检测卵圆细胞凋亡个数;实时荧光定量PCR检测肝脏白蛋白和甲胎蛋白mRNA表达水平;分离2-AAF/PH大鼠术后肝脏库普弗细胞,收集无血清培养液上清;免疫酶联吸附试验检测细胞培养液上清及肝脏组织匀浆中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)表达水平;Western Blot检测肝脏STAT3和磷酸化STAT3的表达情况;EpCAM和α-SMA免疫荧光双标检测卵圆细胞和肝星状细胞相互关系。 结果剔除库普弗细胞后2-AAF/PH大鼠残肝再生受抑,术后第9天卵圆细胞数目及门脉区增殖小管样面积也显著减少。同时,剔除组大鼠卵圆细胞分化也受抑制或被延迟。术后第9天对照组大鼠可见大量新生小肝细胞,而剔除组大鼠卵圆细胞仍然处于幼稚形态。并且,对照组肝脏甲胎蛋白mRNA水平下调,白蛋白mRNA水平明显上调。说明剔除库普弗细胞后卵圆细胞增殖分化均受抑制。然而,卵圆细胞增殖率及凋亡细胞数在两组间没有显著差异;剔除库普弗细胞也不会影响肝星状细胞和卵圆细胞的相互作用,以及肝细胞生长因子(HGF)的合成释放。提示剔除库普弗细胞并不影响卵圆细胞进入细胞周期后的增殖动力学,而可能在更早的阶段产生影响。分离2-AAF/PH大鼠术后6小时的肝脏库普弗细胞培养上清液中TNF-α和IL-6浓度显著增高,这两个经典的炎症因子是启动肝再生的重要因子,主要由库普弗细胞分泌,而剔除库普弗细胞可以导致术后急性期肝脏TNF-α和IL-6水平下降,同时引起下游核因子STAT3磷酸化水平下降。 结论2-AAF/PH模型中库普弗细胞可能通过分泌重要增殖刺激因子TNF-α和IL-6,并激活下游STAT3磷酸化,在术后急性期对卵圆细胞的激活起到重要促进作用。 目的:库普弗细胞是炎症介质的主要来源,参与肝损伤过程,但同时也能发挥肝脏保护作用。2-AAF/PH激活卵圆细胞增殖的模型中,库普弗细胞是表现出介导肝损伤的作用还是肝保护的作用是本部分研究的重点。 方法:将2-AAF/PH卵圆细胞增殖模型大鼠随机分为库普弗细胞剔除组和非剔除对照组。记录并统计大鼠术后生存率;留取术后不同时间点肝脏标本及血清样本,检测两组血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)浓度变化;肝脏切片HE染色观察术后肝脏损伤情况;Caspase-3免疫组化及TUNEL染色检测肝细胞凋亡情况;ELISA检测肝脏IL-10蛋白水平变化。 结果:对照组注射生理盐水的所有2-AAF/PH模型大鼠均良好存活,而剔除库普弗细胞的大鼠死亡率增高,仅有少数能存活到术后第9天(P0.01);肝组织切片HE染色显示剔除库普弗细胞后,肝脏可见明显肝细胞变性及片状坏死灶;剔除库普弗细胞的大鼠肝切除术后AST和ALT水平较对照组升高更明显,且恢复正常较缓慢,至术后第9天仍高于对照组。剔除组术后24小时caspase-3阳性及TUNEL阳性凋亡肝细胞数量均较对照组明显增高(P0.01);而且,剔除组术后IL-10上升较慢,术后6小时肝脏内IL-10蛋白浓度明显较对照组低。 结论:库普弗细胞在2-AAF/PH大鼠肝切除术后起到保护肝脏的作用,其部分机制可能是通过合成分泌IL-10。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329

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