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《华中科技大学》 2010年
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Neogenin/Netrin-1对早孕滋养细胞生物行为及胎盘循环障碍的影响

钟少平  
【摘要】: 随着妊娠的进展,部分细胞滋养细胞分化为绒毛外滋养细胞,弥散侵入子宫蜕膜及肌层上三分之一,并对其中的螺旋小动脉进行重铸,其结果是减少胎盘床末梢血管阻力,使较多的血液无障碍的流入胎盘的绒毛间隙,以保证胎盘和胎儿的正常生长。若滋养细胞功能障碍,导致胎盘“浅着床”,则子宫胎盘循环障碍,胎盘缺血缺氧,引起病理性改变,致流产、胎儿生长受限及子痫前期等病理妊娠发生。最近研究表明,血管新生相关因子与绒毛外滋养细胞侵袭功能密切相关,可能是引起胎盘循环障碍的重要因素。 Netrins是一类高度保守的层粘连蛋白相关的分子家族,对神经细胞的迁移具有吸引和排斥双重作用。近年研究发现,其家族成员Netrin-1,常通过与其特异性配体Neogenin相互作用后介导神经轴突导向生长。基于神经血管发育过程在形态学上的类似性,众多学者亦发现Netrin-1能通过对内皮细胞抑制凋亡、促进增殖和管腔形成来介导血管新生。这一点亦得到我们前期研究的证实。此外,Neogenin可作为一种血管新生因子促进兔角膜囊新生血管生长,但它对滋养细胞生理功能影响的研究尚未见报告。在本研究中,我们研究了Netrin-1在正常妊娠及胎盘循环障碍母胎界面中的表达及分布,同时在体外通过可溶性Netrin-1受体,即Neogenin,结合培养基中游离Netrin-1后,观察人绒毛外滋养细胞株(TEV-1)生物学行为的改变情况,旨在探讨Netrin-1/Neogenin与妊娠期胎盘循环障碍发生的关系,为防治病理妊娠提供有力的实验基础和理论依据。 目的: 1、观察人滋养细胞(TEV-1)经血清剥夺刺激后,VEGF、Netrin-1的表达及分布情况,同时监测TEV-1增殖、凋亡及管腔形成等生物行为的变化,探讨血清剥夺对滋养细胞生物行为的影响及其机制。 2、人滋养细胞(TEV-1)经含不同浓度Neogenin的无血清培养基培养24h后,监测细胞VEGF、Netrin-1、RGMa、DAPK和Neogenin的表达及增殖、凋亡、侵袭和管腔形成等生物行为的变化,探讨Neogenin对滋养细胞生物行为的影响及其机制。 方法: 1、行早孕期滋养细胞株TEV-1培养,并随机分为以无血清培养基处理的实验组及含15%胎牛血清的培养基处理的对照组,应用噻唑兰(MTT)比色法、流式细胞术(FCM)法检测细胞增殖凋亡情况,并监测管腔形成的变化。同时利用免疫荧光细胞化学染色法及实时定量PCR检测VEGF、Netrin-1蛋白表达定位及VEGF、Netrin-1 mRNA变化情况。 2、首先用含0、1、5、10及50ng/ml的Neogenin无血清培养基预处理TEV-1细胞24h,应用噻唑兰(MTT)比色法、流式细胞术(FCM)法检测细胞增殖指数、凋亡率,并采用AO/EB双染法对细胞凋亡进行形态学监测;此外,监测TEV-1穿过Matrigel基质膜情况及管腔形成的变化;同时检测Caspase-3的活性,实时定量PCR检测及RGMa、DAPK、Neogenin、Netrin-1、VEGF mRNA变化情况。Western印迹检测Netrin-1、VEGF蛋白变化情况。 结果: 1、血清剥夺能显著减少TEV-1细胞Netrin-1 mRNA表达水平(p0.05),但对TEV-1细胞VEGFmRNA水平无明显影响(p0.05)。与含血清培养基比较,在无血清培养基中细胞增殖功能明显下降且细胞总凋亡率增加。 2、经不同浓度Neogenin处理24h后,MTT检测各组细胞吸光度值为0.11±0.02、0.08.±0.01、0.12±0.02、0.14±0.07及0.12±0.09。所有数据经统计学处理表明各组细胞增殖能力无明显变化(p0.05) 3、FCM检测表明Neogenin诱导TEV-1凋亡;Neogenin诱导的TEV-1凋亡率随Neogenin浓度增加而变大,当Neogenin刺激浓度达50ng/ml时,滋养细胞总凋亡率达29.6%,较空白组(0ng/ml)6.8%凋亡率显著增加(P0.01)。但各组间Caspase-3活性相比无明显差异(P0.05),与对照组相比,各组Caspase-3活性依次为对照组1.02±0.00、1.06±0.00、0.93±0.02、1.04±0.01。 4、Real-time PCR结果显示:不同浓度Neogenin干预TEV-1细胞24小时后,TEV-1细胞RGMamRNA的表达水平依次为空白对照组(即Ong/ml Neogenin)的0.62±0.04、0.90±0.04、0.90±0.03及0.75±0.03;DAPK mRNA的表达水平在依次为空白对照组的0.68±0.02、0.74±0.01、0.51±0.01及0.33±0.01;Neogenin mRNA的表达水平依次为空白对照组的1.45±0.03、1.22±0.08、1.47±0.00及1.14±0.00。 5、VEGF、Netrin-1蛋白均表达于TEV-1细胞胞浆,在培养的滋养细胞中加入不同剂量的Neogenin干预滋养细胞24h后,滋养细胞Netrin-1表达量均升高,当Neogenin的干预剂量达到50ng/ml时,滋养细胞Netrin-1 mRNA水平较空白对照组约增加44.84倍,呈现一定的量效关系(P0.01)。western印迹检测Netrin-1蛋白未见类似变化趋势。 6、滋养细胞培养24h后可出现管腔形成现象,且这一现象不受血清剥夺及不同浓度Neogenin的影响。 7、经不同浓度neogenin干预TEV-1细胞24小时后,其穿膜能力减弱。 结论:1、血清剥夺后,Netrin-1 mRNA表达显著减少,滋养细胞出现凋亡增加及增殖抑制现象,血清剥夺可能通过影响Netrin-1的表达来参与对滋养细胞增殖凋亡的调控。血清剥夺不影响滋养细胞管腔形成。 2、Neogenin对TEV-1细胞增殖无影响,Neogenin诱导TEV-1凋亡,并呈一定的浓度依赖性,Neogenin不影响滋养细胞管腔形成,Neogenin对TEV-1细胞侵袭功能具有抑制作用。 3、Neogenin下调TEV-1细胞内DAPK mRNA表达、上调Neogenin mRNA表达,不影响RGMa mRNA的表达,推测Neogenin可能通过DAPK途径参与了滋养细胞凋亡的调控。 4、游离Neogenin中和培养基中Netrin-1后,通过Netrin-1/Neogenin信号转导途径,反馈作用于滋养细胞,促进Netrin-1转录及翻译。 目的: 1、了解正常早孕绒毛、蜕膜,正常足月妊娠及子痫前期胎盘及蜕膜中的微血管密度,从而证实血管新生参与妊娠发生。 2、测定相应患者血清VEGF水平及绒毛、胎盘及蜕膜中Netrin-1、VEGF表达情况。并探究Netrin-1、VEGF对血管新生的影响及与子痫前期发病的关系。 3、测定另外收集的正常足月妊娠及循环障碍胎盘中Netrin-1、VEGF蛋白水平,进一步探究Netrin-1、VEGF与胎盘循环障碍发病的关系。 方法: 1、收集16例正常早孕期绒毛及蜕膜,27例足月妊娠和45例子痫前期(其中轻、重度子痫前期分别为21例及24例)胎盘及蜕膜,行免疫组织化学染色法检测微血管表达情况。 2、利用ELISA方法监测1中相应孕妇血清VEGF;水平。并利用免疫组化方法检测绒毛、胎盘及蜕膜中Netrin-1、VEGF:表达情况并行光密度分析。 3、采用免疫印迹法(Western blot)检测另外收集的24例妊娠(其中正常妊娠6例,轻度子痫前期5例,重度子痫前期4例,胎儿生长受限3例,胎儿生长受限合并轻度子痫前期3例,胎儿生长受限合并重度子痫前期3例)胎盘中VEGF及Netrin-1蛋白表达水平。 结果: 1、与正常足月妊娠胎盘相比:1)妊娠早期母胎界面微血管密度较低,以蜕膜为甚;2)轻度子痫前期胎盘及蜕膜血管密度无明显变化;3)重度子痫前期胎盘、蜕膜微血管密度降低(均P0.05)。 2、ELISA方法监测相应孕妇血清VEGF水平显示:正常妊娠晚期患者体内VEGF浓度高于妊娠早期患者体内VEGF浓度。与正常足月妊娠相比,轻度子痫前期VEGF水平变化不明显,重度子痫前期VEGF浓度下降明显(P0.05) 免疫组化检测相应孕妇母胎界面Netrin-1及VEGF结果显示:1.胎盘组织中滋养细胞胞及内皮细胞胞浆可见Netrin-1表达,而VEGF主要见于胎盘组织中内皮细胞部位。孕期蜕膜基质细胞、蜕膜细胞胞浆中均可见Netrin-1及VEGF表达。2.对各组标本进行光密度分析表明:A.与正常足月妊娠胎盘VEGF表达水平相比,早孕绒毛、轻度子痫前期胎盘、早孕蜕膜、轻度子痫前期蜕膜VEGF无明显差异,但在重度子痫前期胎盘及蜕膜内VEGF水平明显下降(P0.05)。B.与正常足月妊娠胎盘Netrin-1表达水平相比,早孕绒毛、轻度子痫前期胎盘、早孕蜕膜、轻度子痫前期蜕膜Netrin-1无明显差异,但在重度子痫前期胎盘及蜕膜内Netrin-1水平明显下降(P0.05)。 3、Western blot检测相应Netrin-1及VEGF蛋白结果显示:1. Netrin-1蛋白在正常足月妊娠组表达最高,而在胎儿生长受限组、轻度子痫前期、重度子痫前期、轻度子痫前期合并胎儿生长受限组及重度子痫前期合并胎儿生长受限组表达水平均减弱,并较正常足月妊娠组下降明显(P0.05)。Netrin-1蛋白表达水平在轻度子痫前期及重度子痫前期合并胎儿生长受限组较正常足月妊娠组极显著下降(P0.01)。2.VEGF在胎儿生长受限组表达水平最高,在重度子痫前期、轻度子痫前期合并胎儿生长受限组及重度子痫前期合并胎儿生长受限组表达下降,其在轻度子痫前期合并胎儿生长受限组及重度子痫前期合并胎儿生长受限组表达水平下降较正常组明显(P0.05)。 结论: 1、Netrin-1、VEGF等影响孕期血管新生。 2、Netrin-1、VEGF在重度子痫前期发病中起到重要作用。 3、与VEGF相比,Netrin-1较VEGF更显著地影响胎盘血管网络构建过程,参与子痫前期合并胎儿生长受限发病过程。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R714.1

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