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小鼠睾丸特异性表达基因TSEG-2的功能初步研究

胡涛  
【摘要】: 第一部分TSEG-2基因真核表达载体的构建及其在细胞内的表达 目的:构建睾丸特异表达基因2 (testis specific expressed gene 2, TSEG-2)的真核表达载体,探讨TSEG-2在细胞中的表达及其生物学功能。 方法:以小鼠睾丸组织cDNA为模版,设计携带HindⅢ和BamHⅠ酶切位点的引物序列,聚合酶链反应扩增基因片段,克隆至携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pEGFP-N1;在阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)的介导下,重组质粒转染体外培养的精母细胞株GC-2spd,荧光显微镜下观察TSEG-2基因在细胞内的表达定位,MTT法测定细胞生长活性,AO/EB荧光染色法、Hoechst 33258荧光染色法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电位,实时定量PCR测定Fas、Bcl-2、Bax表达水平。 结果:.成功构建了TSEG-2与EGFP的融合表达载体pEGFP-TSEG2,转染GC-2spd细胞后可见胞浆内绿色荧光蛋白表达。转染pEGFP-TSEG2 48h后,GC-2spd细胞生长抑制39.2%(P0.05),出现细胞凋亡形态学改变,凋亡率为28.3%(P0.05);线粒体膜电位显著低于对照组(P0.05), GC-2spd细胞中Fas和Bcl-2的表达下调,而Bax的表达上调。 结论:成功构建TSEG-2基因的真核表达载体,在精母细胞株中表达并促进细胞凋亡,并提示TEGS-2可能通过内源性凋亡途径诱导细胞凋亡。为进一步在细胞和动物水平开展TSEG-2功能研究奠定了基础。 第二部分TSEG-2基因在小鼠睾丸扭转复位模型中的表达特征 目的探讨睾丸特异表达基因2(testis specific expressed gene 2,TSEG-2)在小鼠睾丸扭转复位模型中的表达特征。 方法昆明小鼠36只,随机分组为对照组(6只)、假手术组(6只)、单侧睾丸扭转复位实验组(24只)。实验组分为2组,每组12只,左侧睾丸扭转720度维持2 h,分别于复位后1、7天取扭转侧睾丸。采用HE染色、原位末端标记技术(TUNEL)观察睾丸组织形态改变;黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性;原位杂交法观测TSEG-2在睾丸生精细胞内的表达定位;实时定量PCR法检测TSEG-2基因在睾丸组织中的表达水平。 结果对照组和假手术组生精上皮排列规则,扭转复位后1、7天的睾丸组织内生精上皮结构松散,出现生精细胞凋亡,Johnsen's评分分别降低23.4%、64.1%(P0.01),SOD活性降低11.6%、22.2%(P0.05),MDA活性升高69.6%、93.2%(P0.01)。TSEG-2基因表达定位于小鼠睾丸生精小管的精原细胞和精母细胞。与对照组比较,扭转复位1、7天后睾丸组织内TSEG-2表达水平分别上调2.2倍、6.6倍(P0.01) 结论成功建立小鼠睾丸扭转复位模型,TSEG-2表达上调可能与抗氧化酶活性下降、生精细胞凋亡有关。 第三部分睾丸特异性基因TSEG-2在隐睾模型中的表达及其在生精细胞凋亡中的作用 目的进一步探讨睾丸特异表达基因2(testis specific expressed gene 2,TSEG-2)的功能及其在隐睾模型中的表达特点。 方法35只BALB/C小鼠(8周龄)随机分组为单侧手术隐睾组(20只)、假手术组(10只)、空白对照组(5只)。在手术隐睾组中,将右侧睾丸固定于腹壁内侧。real-timePCR法检测TSEG-2基因在隐睾模型中的表达特点。在聚乙烯亚胺(PEI)的介导下,采用睾丸内注射方法,将重组载体pEGFP-TSEG-2(n=5)和空载体(n=5)转染至正常雄性小鼠睾丸,荧光显微镜观测转染效率,TUNEL法检测生精细胞凋亡。 结果原位杂交显示TSEG-2 mRNA表达定位于小鼠睾丸生精小管的精原细胞和精母细胞。与假手术组和对照组比较,隐睾组睾丸组织内TSEG-2表达显著上调(P0.05),生精细胞凋亡比例增高(P0.05)。PEI能有效介导TSEG-2转染至曲精小管,转染1周后生精细胞凋亡显著增多(P0.05)。 结论这些结果提示TSEG-2可能参与了生精细胞的凋亡和隐睾的病理过程。


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