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《华中科技大学》 2010年
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肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植的促血管新生作用

苏冠华  
【摘要】: 第一部分人肝细胞生长因子重组慢病毒载体的构建及病毒的制备 目的:构建能表达重组人肝细胞生长因子(rhHGF)基因的第三代慢病毒载体,为实现rhHGF基因在大鼠骨髓间充质干细胞中长期、高效的表达奠定基础。 方法:(1)通过NheI/XbaI双酶切将pRNAT-U6.2慢病毒载体质粒中GFP基因敲除,然后将目的基因hHGF连接到该载体质粒上,构建重组载体质粒pRNAT-U6.2-hHGF。通过限制性内切酶酶切、菌落PCR和DNA测序进行鉴定。(2)利用TELEVECTORTM载体试剂盒将pRNAT-U6.2-hHGF联合辅助质粒pMDLg/pRRE、pMD2G-VSVG、pRSV-Rev共转染293T细胞,收集并浓缩慢病毒上清,逐孔稀释法测病毒滴度。 结果:(1)经限制性内切酶酶切及DNA测序分析表明,目的基因hHGF-cDNA已经插入载体质粒,且基因序列与基因库序列完全一致;(2)成功制备表达hHGF的慢病毒颗粒浓缩液,滴度为4×108Tu/ml。 结论:表达人肝细胞生长因子的第三代重组慢病毒载体pRNAT-U6.2-hHGF构建成功。 第二部分人肝细胞生长因子在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达及生物学活性观察 目的:观察慢病毒载体介导的人肝细胞生长因子(hHGF)基因在骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)中的表达及其生物学活性。 方法:(1)利用差速贴壁法联合Percoll密度梯度离心法分离、纯化大鼠原代BM-MSCs,流式鉴定MSC的表型,茜素红染色和油红O染色鉴定BM-MSCs的成骨、成脂分化潜能。(2)用高滴度表达hHGF (Lenti-HGF)或GFP (Lenti-GFP)的慢病毒液感染第三代的BM-MSCs,通过倒置相差荧光显微镜和流式鉴定来评估转染效率。ELISA检测细胞培养基上清中的hHGF浓度。(3)分别通过MTT法、Transwell小室法和Hoechst染色法检测脐静脉内皮细胞(HUVECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖、迁移及凋亡,评估感染Lenti-HGF的BM-MSCs分泌的hHGF的生物学活性。 结果:(1)通过联合差速贴壁法和密度梯度离心法可获得大量高纯度、具有多向分化潜能的BM-MSCs。(2)在转染Lenti-GFP后72h,即可在荧光显微镜下见明亮的绿色荧光,最佳感染复数(MOI)为50,流式鉴定转染效率约为75%。ELISA结果显示,Lenti-HGF感染BM-MSCs的培养上清液中的hHGF可持续较高水平地表达14d以上,且明显高于感染Lenti-GFP者(P0.01)。(3)感染Lenti-HGF的MSCs分泌的hHGF在体外显示出促HUVECs增殖、迁移并抑制其凋亡,且能促进VSMCs迁移的生物学活性。 结论:Lenti-HGF慢病毒能够高效地介导转移外源基因hHGF至BM-MSCs表达,并具有生物学活性。 第三部分肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植的促血管新生作用 目的:比较hHGF基因修饰的BM-MSCs移植与单纯BM-MSCs移植在大鼠后肢缺血模型中的促血管新生作用及其机制。 方法:在结扎左股动脉及其分支1天后,SD大鼠随机分为3组:HGF-MSC组(即HGF基因修饰的MSCs移植,n=8),MSC组(单纯的MSCs移植,n=8)以及PBS对照组(注射PBS,n=8)。在术后7天,进行细胞移植。实验组每只大鼠接受总计5×106个同一来源的HGF-MSCs或MSCs,分成5个点注入大鼠缺血后肢的股部肌肉;对照组注入同等体积的无菌PBS。分别在处理后1周或3周时处死大鼠,比较各组缺血股部肌肉中的毛细血管密度,移植细胞的分化转归,T淋巴细胞浸润以及生长因子HGF、VEGF蛋白表达等。ELISA检测HGF-MSC移植前和移植3周后大鼠血清HGF的水平。 结果:细胞移植3周后,MSC组和HGF-MSC组缺血肌肉组织的血管新生均明显增强,以HGF-MSC组的毛细血管密度最高(P0.05)。从移植后1周开始,HGF-MSC组缺血组织中来源于移植细胞的内皮细胞数目明显高于MSC组(P0.05)。在移植1周后,HGF-MSC和MSC的同种异体移植几乎不引起T淋巴细胞浸润,与PBS组相近(P0.05)。Western-blot结果显示,MSC组和HGF-MSC组缺血肌肉组织中HGF、VEGF蛋白表达均明显高于PBS对照组,以HGF-MSC组的表达量最高(P0.05)。HGF-MSC移植前和移植后3周,大鼠血清HGF浓度无明显变化(P0.05)。 结论:与单纯的MSC细胞移植疗法相比,HGF基因修饰的MSC移植疗法具有更强的促进血管新生和侧枝血管形成的能力。以干细胞为基础的血管新生基因治疗策略将可能为治疗严重缺血性心血管病提供新思路。
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