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抗炎症因子对慢性肝炎免疫应答的影响及其机制研究

江敏  
【摘要】: 目的: 1.观测在人的肝脏活检样本中,病毒的感染与组织中抗炎症因子的关系,为进一步研究抗炎症因子在感染免疫中的作用奠定基础。 2.研究抗炎症细胞因子是否影响TLR3诱导的抗病毒活性以及抗病毒介质的产生。探讨抗炎症细胞因子对TLR3受体的表达以及信号通路的影响。了解抗炎症因子对活化的肝脏非实质细胞介导的适应性免疫应答的作用及可能的机制。 3.了解土拨鼠IL-10R的序列,蛋白表达胞外段,制备其多克隆抗体并研究其在WHV慢性感染土拨鼠动物中的作用。 方法: 1.收集病人肝脏活检样本,抽提肝脏总RNA, real time RT-PCR检测HCV病毒RNA, IL-10, TGF-β的表达。 2.分离小鼠非实质细胞并体外培养,poly I:C分别刺激抗炎症细胞因子预处理和未处理的细胞,real time RT-PCR检测细胞中IP-10, IFI-T1, ISG15, TNF-α和IFN-β的表达。病毒保护实验检测上清的抗病毒作用。 3.抗炎症因子预处理非实质细胞,经TLR3配体刺激后,real time PCR和Western blot分别检测TLR3 RNA水平和蛋白水平的表达。利用NF-κB抗体检测其转位和磷酸化。IRF3报告基因转染非实质细胞,再用抗炎症因子预处理,poly I:C刺激细胞后检测IRF3的活化。将抗炎症因子预处理并刺激后的细胞,与同种异体T细胞混合培养,ELISA检测上清IFN-γ的产生,同时检测T细胞的增殖。FACS检测抗炎症因子对TLR3诱导的共刺激分子(CD80, CD86, CD40, MHCⅡ)表达的影响。 4.从正常土拨鼠脾脏组织中克隆IL-10R的序列,测序并比对分析序列与其他物种在RNA水平和蛋白水平的同源性;原核表达IL-10R的胞外段,纯化后免疫家兔获得多克隆抗体,并用ELISA和免疫荧光检测抗体的效价。应用抗体体外阻断IL-10R,检测抗原特异性的T细胞的增殖。 结果: 1.在肝脏活检标本中,HCV的阳性率与TGF-β的表达水平呈现正相关。 2.用抗炎症因子预处理非实质细胞后,再用poly I:C刺激,非实质细胞表达IP-10,IFI-T1, ISG15, TNF-α和IFN-β水平明显被抑制,并且具有明显的剂量依赖效应。预处理后的细胞上清的抗病毒活性也较未处理组减弱。 3.与未处理组相比,抗炎症因子处理组的非实质细胞的TLR3的RNA和蛋白表达水平均明显的降低。抗炎症因子通过抑制NF-κB和IRF3的转位和磷酸化,进而抑制NF-κB和IRF3的活化,从而干扰TLR3的信号通路,抑制TLR3介导的抗病毒效应和免疫应答。 4.TLR3活化的肝脏非实质细胞具有活化同种异体的T细胞的能力,导致T细胞的增殖和IFN-γ的产生。而抗炎症因子的处理则可拮抗这种作用。FACS结果提示,抗炎症因子的处理可以降低TLR3诱导的CD80和CD86表达。 5.土拨鼠IL-10R序列全长1728bp,可编码575个氨基酸,与人和小鼠的IL-10R在核苷酸水平的同源性分别为80.11%和70.60%,在蛋白质水平的同源性分别为71.53%和56.42%。 6.土拨鼠IL-10R胞外段包含621个核苷酸,将其插入原核表达载体pET30a后,转入BL21表达菌,经IPTG诱导后得到约27kDa的原核蛋白。 7.纯化蛋白免疫家兔得到多克隆抗体,抗血清的ELISA效价大约1:50万,免疫荧光效价为1:200。在慢性感染的土拨鼠中,IL-10R的阻断可以上调抗原特异性的T细胞的增殖。 结论: 1.在肝脏活检标本中TGF-β的表达与病毒感染相关。 2.在小鼠肝脏非实质细胞中,外源性的IL-10和TGF-β,可以剂量依赖性的抑制TLR3介导的抗病毒效应以及干扰素应答基因的表达。这种抑制效应与抑制TLR3本身的表达以及其信号通路有关。 3.外源性的IL-10和TGF-β可能通过抑制非实质细胞表面的信号分子表达,进而抑制活化的NPC细胞介导的T细胞的活化。 4.首次获得了土拨鼠IL-10R的全长序列,构建了其胞外段的原核表达质粒,重组质粒经原核表达获得的目的蛋白具有较强的抗原性。利用纯化的蛋白,制备出了抗-IL-10R多克隆抗体,可以用来检测IL-10R在组织或细胞中的表达情况。应用抗体体外阻断IL-10R,有效的上调抗原特异性的T细胞的增殖。本研究的创新点及意义: 1.了解了肝脏活检病人肝内HCV与抗炎症因子表达水平的关系,研究了抗炎症因子是否可以抑制TLR3介导的抗病毒效应,首次在肝脏非实质细胞中探讨了TLR3相关的负调节机制。为研究慢性感染的抗病毒状态和免疫状态提供了参考。 2.了解了抗炎症因子对TLR3本身及其信号通路的影响,并同时观察了抗炎症因子对TLR3介导的T细胞的活化的影响,及其可能的影响途径,为深入的研究其机理提供了实验依据。 3.利用纯化IL-10R蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,为下一步研究IL-10R的生物学功能以及研究IL-10/IL-10R系统在HBV慢性感染中的作用提供了重要的实验工具。


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