核基质结合蛋白SATB1调控肝癌细胞侵袭转移的实验研究

【摘要】： 目的原发性肝癌为最常见恶性肿瘤之一,肝癌患者临床确诊时大部分已出现肝内或肝外转移,是导致死亡的主要原因。肿瘤侵袭转移过程涉及细胞EMT改变、癌细胞迁移等多个方面,许多与肿瘤侵袭转移有关的基因、转录因子及细胞因子等参与其中,彻底阐明它们的相互作用极为困难。最近研究发现核基质结合蛋白SATB1在乳腺癌转移调控中起着重要作用。SATB1与传统转录因子识别特异基因特殊位点不同,它可识别并结合不同基因MAR区富含AT碱基序列从而调控基因复制、转录。本研究将检测SATB1在肝癌组织和细胞中的表达,研究其在肝癌侵袭转移中的作用机制。 方法收集45例原发性肝癌及相应癌旁组织、选择8种不同转移潜能的肝癌细胞株,半定量PCR、western blot、免疫组化及免疫荧光检测SATB1 mRNA和蛋白水平表达,并用real-time PCR对SATB1 mRNA水平进行定量分析。采用shRNA干扰方法和真核表达SATB1全长基因下调或上调高、低转移潜能肝癌细胞株SATB1表达,而后进行以下实验：基因芯片技术筛选SATB1可调控的肝癌侵袭转移相关基因；real-time PCR、CHIP证实SATB1结合肝癌侵袭转移部分相关基因；倒置显微镜下观察细胞形态变化情况；鬼笔环肽标记细胞F-actin,采用激光共聚焦及免疫荧光技术检测细胞骨架重组情况；western blot检测细胞Vimentin、Tight junction protein 1、E-cadherin表达变化；transwell侵袭迁移实验检测细胞侵袭转移能力的改变；裸鼠皮下肿瘤生长实验及原位移植实验检测SATB1对肿瘤生长和转移的调控作用。 结果45例原发性肝癌组织中,28(62%)例癌组织检测到SATB1蛋白水平表达,癌细胞核内可见棕黄色颗粒,癌组织中SATB1表达明显高于癌旁组织(18例,占40%,u=2.1, p0.05), SATB1 mRNA水平定量分析结果显示,SATB1表达与肿瘤直径、分化程度、合并肝硬化以及癌组织转移有关(p0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤结节数无关。HBsAg阳性患者中肝癌组织SATB1 mRNA表达明显高于HBsAg阴性患者(p≤0.01)；8种不同转移潜能的肝癌细胞株中,高转移潜能的肝癌细胞SK-Hep-1、HCCLM8、MHCC-97H中SATB1 mRNA高表达(Ct值分别为2.83±0.6、2.72±0.54、2.09±0.28),中、低转移潜能肝癌细胞株MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、Huh7中SATB1mRNA低表达(Ct值分别为0.29±0.1、0.35±0.11、0.19±0.08、0.14±0.02,与高转移潜能的肝癌细胞相比,p0.05),无转移能力Hep3B细胞中几乎无SATB1表达；高转移潜能SK-Hep-1细胞抑制SATB1后基因芯片技术检测结果表明,1450个基因表达上调2倍,1635个基因表达下调2倍；低转移潜能肝癌SMMC-7721细胞上调SATB1表达,1286个基因表达上调2倍,1463个基因表达下调2倍,两组结果对比,SATB1可调节肝癌侵袭转移基因有近200个,如粘附分子CDH3、FNl,信号转导基因TCF4,抑癌基因APC,蛋白酶MMP12、SLPI、CTSL1,转录因子Ets1,转移相关基因SERPINB5、VIL2等,对其中部分基因采用real-time PCR、CHIP实验方法研究,结果显示,SATB1可与这些基因MAR区相应位点结合并调控其表达；SK-Hep-1细胞抑制SATB1表达后,细胞形态明显改变,长纺锤体细胞收缩呈多角形,细胞规律方向性生长改为呈岛状增殖,鬼笔环肽标记细胞F-actin后,激光共聚焦显微镜下观察发现细胞骨架消失,横贯于细胞长轴的粗大应力纤维解聚成细小微丝,散布于细胞核周围,而SMMC-7721细胞上调SATB1表达后,椭圆形细胞拉长变为长纺锤体形,细胞间隙增宽,细胞长轴方向可见明显聚集的应力纤维,与抑制SATB1表达诱导细胞形态和骨架变化相反；抑制SATB1表达后,western blot检测细胞形态、骨架改变相关关键蛋白分子,发现Tight junction protein 1 (0.62±0.02 vs 0.06±0.01,p0.01)、E-cadherin表达增强(0.82±0.04 vs 0.42±0.01, p0.05), Vimentin表达下降(0.27±0.02vs 0.57±0.06,p0.05),上调SATB1表达后,与对照相比,Tight junction protein 1 (0.35±0.01 vs 0.51±0.04, p0.05)、E-cadherin表达下降(0.36±0.02 vs 0.64±0.06,p≤0.01), Vimentin表达增强(0.64±0.03 vs 0.34±0.04, p0.05); transwell侵袭迁移实验结果表明,抑制SATB1表达,穿过基质胶的细胞较对照组明显减少(OD值0.16±0.02vs 0.33±0.05,p0.05),迁移实验示穿过膜孔细胞较对照减少(OD值0.76±0.12 vs0.22±0.06,p0.05)；上调SATB1表达,穿过基质胶的细胞明显增多,实验组与对照组相比p0.05(0.67±0.08 vs 0.26±0.04);迁移实验示穿过膜孔细胞增多,实验组与对照组相比p0.05(0.79±0.11 vs 0.26±0.04)；裸鼠皮下肿瘤生长实验表明,下调SATB1表达,实验组与对照组肿瘤平均重量分别为0.14±0.02g、0.43±0.06g(p0.05),上调SATB1表达,实验组与对照组肿瘤平均质量分别为0.57±0.05g、0.2±0.07g(p0.05)。肝癌组织原位移植(肿瘤组织接种到肝脏)实验检测SATB1上调或下调后对肿瘤侵袭转移能力的影响,因裸鼠在观察期内死亡,未观察到活体肿瘤侵袭转移方面的改变。 结论SATB1在肝癌组织中高表达,其表达与肝癌组织远处转移有关,转移能力越强的肝癌细胞株,SATB1表达越高；下调或上调SATB1表达,可调控许多肝癌侵袭转移相关基因表达,SATB1可与这些基因MAR区相应位点结合并调控其表达,诱导细胞出现MET-EMT样的形态、骨架改变,并调控Vimentin、Tight junction protein 1、E-cadherin蛋白表达的增强或下降；下调或上调SATB1表达的综合效应为肝癌细胞株侵袭转移能力的降低或增强。体内实验表明,SATB1可调控肿瘤生长。