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《华中科技大学》 2010年
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ABCG2在鼻咽癌中的表达及其在鼻咽癌化疗中的作用

俞艳萍  
【摘要】: 目的:探讨ABCG2在鼻咽癌活检标本及鼻咽癌细胞系CNE-2中的表达及其与鼻咽癌化疗中的多药耐药性的关系。 材料和方法:鼻咽癌活检标本取自30位鼻咽癌患者,对照组粘膜是20份鼻咽炎性组织,取自20位慢性鼻咽炎患者的鼻咽部活检组织。采用实时定量PCR(Real-time PCR)检测ABCG2 mRNA的表达,用免疫组化的方法检测ABCG2蛋白的表达。 结果:鼻咽癌活检组织中,ABCG2在mRNA水平和蛋白水平的表达均高于鼻咽炎性组织中的表达(t=5.4060,P=0.0124),而且在伴有淋巴结转移的患者中,其表达显著增高(t=5.4547,P=0.014)。我们用低浓度的托泊替康(0.75μg/ml)和盐酸米托蒽醌(0.6μg/ml)分别处理CNE-2细胞24小时,48小时和72小时。Real-time PCR的结果表明在托泊替康或者盐酸米托蒽醌处理之后,ABCG2 mRNA表达增高,并与处理时间正相关(r=0.9857,P=0.0143)。 结论:ABCG2在鼻咽癌中相对高表达,与淋巴结转移相关,很可能是淋巴结转移的一个分子标志,而且ABCG2可能参与了鼻咽癌化疗中的多药耐药。 目的:探讨ABCG2在Mitoxantrone处理CNE-2细胞过程中的作用 方法:用不同浓度Mitoxantrone (0,10 nM,20 nM,40 nM,60 nM,80 nM)处理CNE-2细胞24h,48h和72h后,用MTT法分析加入ABCG2特异性抑制剂FTC前后其IC50的变化,并用Realtime-PCR和Western Blot检测Mitoxantrone处理前后ABCG2mRNA和蛋白的表达。 结果:在5μM FTC存在时,CNE-2细胞24h,48h和72h的IC50都减少约30%。说明当ABCG2的作用被抑制后,CNE-2细胞对Mitoxantrone更敏感。通过用Realtime-PCR发现Mitoxantrone可以诱导ABCG2 m RNA的表达,并且有药物浓度依赖性,在24h,48h和72h的相关系数分别是r2=0.9520,P=0.0009;r2=0.8826,P=0.0054 and r2=0.9351,p=0.0016,也与作用的时间正相关,Mitoxantrone10nM,20 nM,40 nM,60 nM,80 nM时,相关系数分别是r2=0.9505,P=0.0251;r2=0.9650,P=0.0177;r2=0.9923,P=0.0039;r2=0.9671,P=0.0166;r2=0.9672,P=0.0155。WB检测蛋白的表达与Real-time PCR的结果相一致。 结论:用Mitoxantrone处理CNE-2细胞时,细胞膜上表达的ABCG2可能将细胞内的Mitoxantrone转运出去以保护细胞,这也可能是ABCG2参与多药耐药性的机制。 目的:构建靶向人ABCG2基因的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒,运用RNA干扰下调ABCG2基因在鼻咽癌细胞系CNE-2中的表达,并筛选出其基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。 方法:针对ABCG2基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,用real-time PCR和western blot检测ABCG2基因在mRNA和蛋白水平检测抑制效果。 结果:经测序证实,成功构建pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒。重组质粒转染CNE-2细胞后,ABCG2基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以1号重组质粒效应最强,mRNA水平下调75%,蛋白水平下调68%。 结论:成功构建以人ABCG2为靶向的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2的重组质粒。其对鼻咽癌CNE-2细胞中ABCG2的表达具有显著抑制效应,为进一步研究ABCG2在CNE-2细胞中的功能和鼻咽癌的基因治疗奠定了基础. 目的:观察沉默ABCG2基因的表达后,CNE-2细胞对Mitoxantrone敏感性的变化,探讨ABCG2在鼻咽癌细胞系CNE-2耐药中的作用机制。 方法:建立转染pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核质粒和转染control质粒的稳定单克隆细胞,用不同浓度的Mitoxantrone (0,10 nM,20 nM,40 nM,60nM,80 nM)处理CNE-2, CNE-2/siRNA-ABCG2和CNE-2/control细胞24h,48h和72h,用MTT实验分析三个时间点,每种细胞的IC50;并用35.3 nMMitoxantrone(24h时CNE-2细胞IC50的浓度)处理CNE-2, CNE-2/siRNA-ABCG2和CNE-2/control细胞24h,用CCK-8和流式细胞检测分析各种细胞的增殖情况和细胞周期的变化。 结果:在24h,48h和72h三个时间点,CNE-2/siRNA-ABCG2细胞的IC50s均比CNE-2细胞要低(t=11.9137,P=0.0003);用35.3 nM Mitoxantrone (24h时CNE-2细胞IC50的浓度)作用CNE-2, CNE-2/siRNA-ABCG2和CNE-2/control细胞,每天用CCK-8检测细胞生长情况,连续检测十天,绘制生长曲线,发现CNE-2/siRNA-ABCG2细胞的增殖与CNE-2细胞相比,明显减慢(t=2.2614,P=0.036);35.3nM Mitoxantrone处理之后,CNE-2细胞中凋亡细胞的比例从8.70%增加到20.91%,G1期细胞的比例从37.22%增加到40.43%,G2/M期细胞比例从33.76%下降到17.54%, CNE-2/siRNA-ABCG2细胞中凋亡细胞的比例由8.32%增加到29.73%,G1期细胞的比例由39.94%增加到41.15%,G2/M期细胞比例由30.47%下降到6.7%。 结论:转染pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核质粒的CNE-2/siRNA-ABCG2细胞对Mitoxantrone的敏感性增加。 目的:探讨ABCG2在Mitoxantrone处理鼻咽癌裸鼠移植瘤过程中的作用 方法:建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,用10nM Mitoxantrone分别在CNE-2,CNE-2/siRNA-ABCG2以及CNE-2/control细胞形成的移植瘤的体部和基底部多点微量注射,注射等体积的PBS作为对照组,记录肿瘤体积的增长曲线,并在4周后处死裸鼠,取出移植瘤,用TUNEL检测肿瘤的细胞原位凋亡率。 结果:60只裸鼠无一死亡,体重均匀增加,成瘤率100%。在CNE-2组,CNE-2/siRNA-ABCG2组和CNE-2/control组中,注射Mitoxantrone组的肿瘤体积的增长均比相应的注射PBS组要慢;CNE-2组和CNE-2/control组之间,注射Mitoxantrone组和注射PBS组的肿瘤体积的增长均无明显差异(t=0.9678,P=0.3460);在CNE-2组,CNE-2/siRNA-ABCG2组和CNE-2/control组中,三组注射PBS的裸鼠肿瘤体积增长均无明显差异(P0.05);在CNE-2组和CNE-2/siRNA-ABCG2组中,用Mitoxantrone处理后,CNE-2/siRNA-ABCG2组肿瘤体积增长明显比CNE-2组要慢(t=2.6255,P=0.0172)。对取出的移植瘤进行原位TUNEL检测,发现各组的凋亡率各不相同。在CNE-2/siRNA-ABCG2组,凋亡率为29.45±5.29%,在CNE-2组,凋亡率为18.51±4.33%,而在CNE-2/control组的凋亡率为12.13±6.04%。在CNE-2组,CNE-2/siRNA-ABCG2组和CNE-2/control组三组中,用PBS处理的肿瘤凋亡无明显差异。 结论:抑制了ABCG2基因的表达后,CNE-2移植瘤对Mitoxantrone的敏感性增强,ABCG2的表达是鼻咽癌耐药的重要原因。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R739.63

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