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《武汉科技大学》 2018年
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HDAC6在炭黑颗粒致人支气管上皮细胞炎症反应中的作用

左瑶  
【摘要】:目的:探讨组蛋白去乙酰化酶6在炭黑颗粒诱导支气管上皮细胞炎症反应中的作用。方法:体外培养人支气管上皮细胞(16HBE),以细胞空白为对照组,分别用12.5、25、50、100μg/ml浓度的炭黑颗粒(Printex90)染毒细胞12、24、36、48 h后,采用Cell Counting Kit-8法(CCK-8)检测细胞活力确定染毒时间。采用HDAC6siRNA预处理16HBE细胞,将实验分为六组,细胞空白对照组、25μg/ml炭黑颗粒组、50μg/ml炭黑颗粒组、HDAC6 siRNA干扰空白组、25μg/ml炭黑颗粒+HDAC6 siRNA干扰组、50μg/ml炭黑颗粒+HDAC6 siRNA干扰组,染毒24 h后,收集染毒细胞和上清液,采用RT-PCR检测HDAC6基因mRNA相对表达水平,WB检测细胞内HDAC6、纤毛内转运蛋白IFT88和自噬体蛋白LC3-Ⅱ等蛋白表达水平,ELISA检测细胞上清液中IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β1和IL-17A等炎性细胞因子的释放量。结果:(1)在染毒各个时间点,炭黑颗粒染毒16HBE细胞后可导致细胞活力明显下降,随着炭黑颗粒浓度的增加,细胞存活率明显下降,呈现较明显的剂量反应关系,且随着染毒时间的延长,16HBE细胞活力也逐渐下降。炭黑颗粒作用于16HBE细胞24 h后细胞内HDAC6 m RNA相对表达水平先升高后下降,当炭黑颗粒浓度为12.5μg/ml时,细胞内HDAC6 mRNA表达水平升高,但随着炭黑颗粒浓度的升高,细胞内HDAC6 mRNA的表达水平逐渐下降,当炭黑颗粒浓度达到100μg/ml时,HDAC6 mRNA表达显著低于细胞空白对照组(P0.05)。但染毒后细胞内HDAC6蛋白的表达水平随着炭黑浓度的升高逐渐增加,当炭黑浓度为25μg/ml时,HDAC6蛋白表达水平达到最高,当炭黑颗粒浓度为100μg/ml时HDAC6蛋白表达降低至正常水平。炭黑颗粒染毒的细胞内自噬体蛋白LC3-Ⅱ的表达水平增加,而IFT88蛋白水平呈逐渐下降趋势,当炭黑颗粒浓度在100μg/ml时,LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著高于细胞空白对照组(P0.05);当炭黑颗粒浓度≧50μg/ml时,IFT88蛋白表达水平显著低于细胞空白对照组(P0.05)。细胞上清液中炎性细胞因子IL-8、IL-1β、TGF-β_1和IL-17A的表达水平随着炭黑颗粒浓度的升高呈上升趋势,当炭黑颗粒浓度≧25μg/ml时,IL-8的表达水平显著高于细胞空白对照组(p0.05),当炭黑颗粒浓度≧50μg/ml时,TGF-β_1的表达水平显著高于细胞空白对照组(p0.05),当炭黑颗粒浓度为100μg/ml时,IL-1β和IL-17A的表达水平高于细胞空白对照组,差异具有统计学意义(p0.05);但TNF-α和IL-6的表达水平略高于细胞空白对照组,差异无统计学意义(P0.05)。(2)与正常染毒细胞组比较,炭黑颗粒+HDAC6 siRNA干扰组HDAC6 mRNA表达水平显著下降(P0.05)。当炭黑颗粒浓度为50μg/ml时,HDAC6 siRNA干扰的细胞内IFT88蛋白水平显著高于HDAC6 siRNA干扰细胞空白组(P0.05);但自噬体蛋白LC3-Ⅱ表达水平略下降。50μg/ml炭黑颗粒+HDAC6 siRNA干扰组细胞释放IL-8、IL-6和TGF-β_1水平显著升高,TNF-α显著下降,与HDAC6siRNA干扰的细胞空白组相比,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:炭黑颗粒可导致16HBE细胞活力明显下降,细胞内HDAC6蛋白表达水平和纤毛自噬的水平升高,且诱导细胞释放IL-8、IL-1β、TGF-β1和IL-17A等多种炎性因子的水平显著升高,HDAC6 siRNA干扰细胞后,可抑制炭黑颗粒诱导16HBE细胞自噬的水平,导致纤毛内转运蛋白IFT88表达升高,细胞分泌TNF-α水平下降,而IL-8、IL-6和TGF-β1炎性细胞因子的水平升高,提示HDAC6可能通过影响纤毛自噬水平参与炭黑颗粒诱导肺部炎症反应过程。
【学位授予单位】:武汉科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R114

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