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《长江大学》 2019年
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菌株S17-377的鉴定及其对水稻纹枯病防治作用机制的研究

李雪婷  
【摘要】:本研究旨在从健康水稻植株的根际土壤中分离和筛选对水稻纹枯病具有良好防治效果的生防细菌,并对其进行鉴定、发酵条件优化和生防作用机制的初步研究。主要研究结果如下:从我国9个地区采集的45份水稻根际土壤样品中获得390株细菌分离物。通过平板对峙法,筛选出28株对水稻纹枯病菌有抑制效果的菌株,其中抑菌效果最佳的为菌株S17-377,抑菌带宽达10 mm。根据形态学和分子生物学特征,S17-377被鉴定为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)。菌株S17-377的无菌滤液与PDA培养基混合制板,混合比例为1:20,1:10,1:5时对水稻纹枯病病菌菌丝的生长抑制率分别为77.14%、86.92%和98.26%,且能抑制菌核的形成。无菌滤液可导致水稻纹枯病菌的部分菌丝膨胀、皱缩和断裂。S17-377对草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)等14种病原真菌的抑菌率为22.50%-90.90%;对柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)、魔芋软腐病菌(Ervinia carotovora)、黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)和生姜青枯病菌(Ralstonia solanacearum)病原细菌的抑菌圈达9.75mm-13.14mm。离体防效实验结果显示菌株S17-377处理后水稻叶片无任何伤害,发病面积减少了84%。盆栽实验结果表明菌株S17-377发酵液对水稻植株处理三次后,对纹枯病的防效为65.93%。菌株S17-377在培养基为基础盐培养基,pH为5.0,培养时间为120 h或144h时,抑菌活性最强。S17-377发酵液对水稻植株具有较强的的抗病诱导效果,处理后水稻叶鞘的PAL和POD活性呈上升趋势,PPO活性呈先上升后下降的趋势。此外,S17-377还可激活水稻防御基因(NH1、PR1a、PR10、PAL/ZB8、LOX、AOS_2)的表达。生防菌S17-377可产生蛋白酶、几丁质酶和嗜铁素,但不能产生纤维素酶。菌株S17-377可形成生物膜,形成的强度与细菌的浓度有关,浓度为OD_(600)=0.6时的生物膜强度显著大于浓度为OD_(600)=0.8、1.0。通过绿色荧光蛋白基因标记获得标记菌株S17-377GFP,转化后菌株S17-377GFP和原始菌株S17-377形态一致、生长差异不明显、遗传稳定性达75%以上,且不影响其对水稻纹枯病菌的抑菌作用。通过荧光显微镜观察发现,菌株S17-377GFP可定殖于水稻叶表皮、叶肉细胞和维管束中。菌株S17-377的抑菌活性物质对温度并不敏感。采用盐酸沉淀、硫酸铵沉淀及有机溶剂萃取法粗提生防菌株的活性成分,发现正丁醇粗提物、蛋白类粗提物和脂肽类粗提物(浓度为50μg/mL)对水稻纹枯病菌的的抑菌率分别为95.23%、94.43%、75.11%,其中正丁醇粗提物对纹枯病菌的EC_(50)为8.95μg/mL。通过GC-MS检测正丁醇提取物,发现粗提物中含有38种化合物,其中匹配度高达90%以上的化合物有7种,9-甲基-十九烷、甘氨酸-L-脯氨酸、正十七烷、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、烟碱。其化学式分别为:C_(20)H_(42)、C_7H_(10)N_2O_2、C_(17)H_(36)、C_(16)H_(22)O_4、C_(16)H_(32)O_2、C_(24)H_(38)O_4、C_(10)H_(14)N_2。
【学位授予单位】:长江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S435.111.42

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