塔克拉玛干沙漠微生物固氮酶基因多样性及其活性的研究

【摘要】：生物固氮是自然生态系统中氮循环的重要环节,是自生固氮微生物和共生固氮微生物通过体内固氮酶的作用,将空气中的N2催化形成NH4+的过程。由铝铁蛋白和铁蛋白组成的钼铁固氮酶是固氮微生物细胞中最为普遍的一类固氮酶体系,在固氮微生物不同种间,nifH基因编码的铁蛋白的氨基酸序列存在很高的同源性,且利用nifH基因和16S rRNA基因序列分别构建的系统发育树有一致的进化表征特性。因此,nifH基因常被用作标记基因检测各生态环境中固氮微生物的群落结构及其多样性。由于缺少灌溉,生物垃圾少以及氮素矿化作用,沙漠土壤中氮的含量非常低。沙漠植物生长过程中所需要的氮素,主要来源于地下水和微生物参与的生物固氮作用。研究表明,沙漠中生长的灌木主要依靠根系的共生固氮菌固氮提供生长所需要的氮源,而由异细胞固氮蓝藻等微生物组成的生物结皮是沙漠中主要的固氮执行者,一公顷成熟的结皮每年可以固定约9 kg气态氮。塔克拉玛干沙漠是我国最大的沙漠,具有极端干燥的内陆型气候,光热充足,干燥少雨,日照强烈,温差变化大和多风沙天气等特点。为了全面了解塔克拉玛干沙漠植被及无植被土壤中固氮微生物群落结构及其固氮酶活性,本文以新疆沙漠七个土壤样品为研究对象,采用培养法从三个胡杨林土壤样品中分离可培养的微生物和固氮微生物,采用文库构建和限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)两种分子生物学方法对七个样品中的固氮酶基因nifH的多样性进行聚类分析,同时采用多相分类法对两个潜在的微生物分类单元进行分类鉴定并检测它们的固氮酶活性,得到如下结果：(1)从新疆沙漠三个胡杨林土壤样品中成功分离38株细菌,他们主要隶属于放线菌门、拟杆菌门,变形菌门和厚壁菌门的16个属,其中放线菌门和厚壁菌门细菌为新疆沙漠胡杨林土壤中的优势菌群。三个胡杨林样品中,塔克拉玛干沙漠胡杨林土壤栖息的微生物多样性最好。(2)从新疆沙漠三个胡杨林土壤样品中分离获得能在无氮培养基中反复传代培养的16株固氮菌,这些细菌的固氮酶基因nifH被成功克隆；通过乙炔还原法对其中一个细菌的固氮酶活性进行了准确测定,表明沙漠生态系统中栖息着一定数量的自生固氮菌。(3)三个无植被土壤样品和三个胡杨林土壤样品的nifH基因文库被成功构建,六个文库的覆盖率范围为74.1%-91.9%,共获得197个nifH基因特异性序列,在97%序列相似性水平下聚类生成84个不同的运算分类单位(operational taxonomic units, OTU)。84个OTU代表性nifH序列分属于nifH基因簇的第一、二和三簇,其中65个OTU聚类在nifH基因的第一簇,5个OTU聚类在nifH基因的第二簇,14个OTU聚类在nifH基因的第三簇。六个文库中的部分nifH基因聚类为两个单独的分支,这些nifH序列与已发现的可培养微生物中的nifH基因序列存在极低的同源性(83%),表明新疆沙漠土壤中蕴藏着独特的固氮微生物或具有独特固氮酶基因的微生物资源。(4)可培养固氮微生物以及六个文库中获得的绝大多数nifH基因序列均聚类于nifH基因α-变形杆菌门亚簇,表明α-变形杆菌门细菌的nifH基因在沙漠固氮微生物中占有很大的丰度,且固氮酶nifH基因的水平基因转移现象可能在沙漠微生物中普遍存在。(5)六个文库中nifH基因的聚类分布比较结果显示,无植被区土壤样品中微生物的nifH基因多样性明显低于胡杨林土壤样品中微生物的nifH基因多样性,表明土壤的理化性质与其栖息的固氮微生物多样性存在相关性,同时也暗示着生长在沙漠土壤中的各类植被或生物结皮,在沙漠生态系统N循环过程中发挥着重要的作用。(6)从塔克拉玛干沙漠胡杨林土壤样品中分离得到五个潜在的微生物分类单元,对其中两个菌株H4XT和H9XT进行了多相分类学鉴定。菌株H4XT为革兰氏阴性好氧杆菌,能在0.1×TSB培养基或0.3xMB培养基平板上形成圆形,凸起,表面湿润光滑的深红色菌落。菌株H4XT能在温度为4.0-40.0℃C,pH为6.0-8.0,NaCl浓度为0-8.0%(w/v)的培养基中生长,其16S rRNA基因序列与海洋杆菌属(Pontibacter)其他菌株的16S rRNA基因序列的相似性为94.2-96.8%,呼吸醌主要成分为MK-7(甲基萘醌类),主要脂肪酸为iso-C15:0, C16:lco5c, summed feature 3(包括C16：1 ω6c和/或C16：1 cω7c)和summed feature 4(由anteiso-C17:1B和/或iso-C17：1 I组成),主要极性脂成分为磷脂酰乙醇胺,一个氨磷脂和四个未知磷脂,G+C含量为46.6 mo1%。该菌株含有固氮酶nifH基因,固氮酶活性为7.13±1.2nmol/h/108cells。菌株H4XT是首次报道的Pontibacter属固氮菌,命名为Pontibacter diazotrophicus sp. nov. H4XT,并被保存于两个微生物菌种保藏中心,保藏号为CCTCC AB 2013049T和NRRLB-59974T。菌株H9XT为革兰氏阴性好氧杆菌,能在0.1×TSB培养基或0.3xMB培养基平板上形成圆形,凸起,表面湿润光滑的红色菌落。菌株H9XT能在温度为4.0-37.0℃C,pH为6.0-10.0,NaCl浓度为0-7.5%(w/v)的培养基中生长,其16SrRNA基因序列与Pontibacter属其他菌株的16SrRNA基因序列的相似性为94.2-96.3%。菌株H9XT的呼吸醌主要成分为MK-7(甲基萘醌类),主要脂肪酸为iso-C15:0, C16:1ω)5c,summed feature 3(包含C16：1ω6c和/或C16：1 cω7c)和summed feature 4(由anteiso-C17:1B和/或iso-C17:1I组成),主要极性脂成分为磷脂酰乙醇胺、一个氨磷脂,一个糖磷脂和五个未知磷脂,G+C含量为55.2mm01%。菌株H9XT被命名为Pontibacter yuliensis sp. nov. H9XT,并被保存于两个微生物菌种保藏中心,保藏号为CCTCC AB 2013047T和KCTC 32396T。本文研究结果表明,新疆沙漠生态系统中蕴藏着丰富而独特的固氮微生物,这些微生物资源的发掘及其新功能基因的开发利用具有很好的理论研究意义和潜在的应用价值；同时也为了解沙漠生物固氮作用提供了科学依据,为揭示极端干旱和贫瘠地质环境条件下固氮微生物参与氮循环的过程与机制提供了理论依据。