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《武汉轻工大学》 2016年
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一株快速生长分枝杆菌新种的鉴定及其胞壁脂聚糖功能研究

雷航  
【摘要】:目的:对临床分离株WH798进行菌种鉴定,对三种来源的脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)结构差异比较,并对LAM影响树突状细胞成熟及下游免疫反应的作用进行初步探索。材料和方法:16S rRNA基因鉴定结合生长生化试验对临床株WH798进行菌种鉴定;应用实验室课题组前期实验方法分离纯化得到LAM;15%凝胶电泳联合硝酸银染色法进行显色鉴定;Western blot方法对三种不同LAM进行特异糖基检测检测,分析三种LAM结构差异;i DC是由C57BL/6小鼠骨髓细胞诱导生成;流式细胞术、ELISA方法、Real-time PCR方法分别检测LAM刺激后DC的成熟、细胞因子分泌及细胞表面主要受体的表达情况,从而分析LAM对DC成熟情况的影响、DC对LAM识别不同时期受体情况并根据细胞因子表达情况分析LAM对后期免疫的影响。结果:临床菌株WH798为一株快速生长且抗酸阳性的非结核分枝杆菌。分离纯化出三株目的菌株胞壁的LAM;经硝酸银染色发现:依据LAM分子量由大到小,结核分枝杆菌H37Rv的LAM最大,其次为临床菌株WH798,耻垢分枝杆菌mc2155最小。Western-bolt实验结果显示PSA、Con A能够与临床菌株WH798和结核分枝杆菌H37Rv的LAM相互作用并且结合强弱存在差异,但不能识别耻垢分枝杆菌LAM中的糖基。流式细胞术结果显示,H37Rv和WH798的LAM均可诱导树突状细胞成熟,但是mc2155 LAM则基本不能诱导树突状细胞成熟。Real-time PCR检测发现三种LAM刺激树突状细胞后三种受体表达是不一样的,在6h时,只有MR在三种LAM刺激后均呈现表达上升的趋势;而24h时MR和DC-SIGN受体表达量有上升;结果表明在感染前期LAM的受体主要为MR和Dectin-2,而在感染的后期则是DC-SIGN受体起着主导作用。ELISA检测结果表明,不同的LAM均能刺激树突状细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p40,且不同菌株的LAM对树突状细胞细胞因子分泌量的影响是不一样的。临床菌株WH798和结核分枝杆菌H37Rv能够明显的刺激树突状细胞分泌IL6、IL-12p40和TNF-α,另外该三种均能诱导IL-1β的分泌,但强度都是很微弱。根据细胞因子分泌情况分析,可以发现临床菌株WH798能明显促进树突状细胞对IL-6、IL-12p40、IL-1β及TNF-α的分泌,表明WH798菌株有诱导Th0细胞向Th1或Th17极化的能力。结论:临床菌株WH798得到了菌种鉴定,并对三种不同菌株LAM进行了分离纯化,采用凝集素初步探讨了三种不同脂聚糖的结构差异,发现不同菌株来源的LAM免疫能力存在差异,可能与LAM间分子量和结构差异有关,且试验中三种脂聚糖均能诱导树状细胞成熟并影响Th0细胞的极化方向,其中H37Rv和WH798LAM具有诱导Th0向Th17极化的能力。
【学位授予单位】:武汉轻工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q93

【参考文献】
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【共引文献】
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