收藏本站
《武汉轻工大学》 2016年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

环己胺降解菌NyZ12胺氧化酶基因敲除突变体的构建及特性研究

毛灵琪  
【摘要】:本实验的目的是研究假单胞菌NyZ12降解环己胺的分子机制,找到其中起降解环己胺作用的胺氧化酶基因。环己胺是一种易燃、有毒的有机污染物,在生产和使用过程中,被释放的环己胺废气对环境和人体有很大的危害性。而微生物降解有机污染物有成本低、效率高等优点,因此找到一种能降解环己胺的微生物并研究其降解机制对降低环境中环己胺的污染至关重要。目前报道的以环己胺为碳源和氮源生长的纯培养物主要有两株,一株由日本人IwakiH.等分离筛选到的革兰氏阳性菌BrevibacteriumoxydansIH-35A,另一株由中国科学院武汉病毒研究所周宁一研究组分离的革兰氏阴性菌PseudomonasplecoglossicidaNyZ12。通过对NyZ12全基因组测序获得该菌株的全基因组信息。利用数据库比对分析,我们预测了5个基因可能与环己胺降解代谢过程有关,分别是amo425、amo2631、amo4207、amo4637和amo5539。本实验从遗传学角度研究基因是否参与环己胺代谢,对五个基因进行敲除,通过观察突变体特性变化来进一步分析基因功能。具体实验过程分为四步:1.同源片段扩增:设计合适的敲除引物扩增目的基因上下游同源臂,再利用重叠PCR技术将上下游同源臂融合。2.构建敲除载体:将融合片段克隆到pGEM-TEasy载体上转化至大肠杆菌,酶切鉴定并测序。测序鉴定正确的重组T载体与自杀载体pEX18km双酶切后连接转化到大肠杆菌并鉴定。3.结合转移:再将鉴定正确的重组质粒转化到E.coliS17λpir菌株与野生菌NyZ12进行结合转移,使含有同源片段的自杀载体在野生菌细胞内进行同源重组。4.突变体筛选及特性研究:利用抗生素抗性和PCR鉴定来筛选突变菌株,将基因敲除的突变菌株接种于环己胺无机盐培养基进行生长情况研究。设计了两种敲除方法,在目的基因内部插入抗生素基因的插入突变和利用重叠PCR技术使目的基因部分缺失的无痕敲除。结果利用插入突变敲除基因amo2631后突变体生长变慢,但考虑到抗生素基因插入可能导致的极性效应对细菌生长造成影响,后来使用无痕敲除技术进行基因敲除,结果显示单个目的基因敲除对生长没有明显影响。我们推断环己胺代谢途径中可能涉及多基因参与,后续考虑对胺氧化酶基因累积敲除。通过基因组分析发现编码分解环己醇或环己酮到己二酸的基因orf2866-2870位于一个操纵子上,转录组分析表明位于整个操纵子的五个基因受底物诱导表达水平上调。通过荧光定量PCR对操纵子上各个基因的表达水平进行进一步确认。接着对环己酮单加氧酶chnB(orf2867)进行无痕敲除,敲除突变体在环己胺和环己酮的无机盐培养基中都不生长。在突变体的restingcell中,加入环己胺,通过气相色谱在其上清液中检测到环己酮生成,证明环己胺代谢过程是通过中间产物环己酮降解的。接着对chnB敲除菌进行了回补实验,成功构建了回补突变株,其在底物环己胺和环己酮培养基上恢复生长能力。
【学位授予单位】:武汉轻工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:X172

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 华颖;孙琦;王湘雨;杜艳丽;邵娜;张其威;赵卫;万成松;;肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株和回补株的构建[J];南方医科大学学报;2015年11期
2 王丽;多丽波;;基因敲除技术在肺炎克雷伯菌基因功能研究中的应用进展[J];临床检验杂志;2015年05期
3 陈振鸿;王丽;张义全;冯娇;杨瑞馥;常德;安莉;刘长庭;周冬生;;副溶血弧菌基因回补实验方法的建立与应用[J];南方医科大学学报;2014年01期
4 陶果;信吉阁;肖晶;刘海京;成文敏;查星琴;曾养志;;基因敲除技术最新研究进展及其应用[J];安徽农业科学;2013年29期
5 胡逢雪;丁锐;崔震海;于金龙;刘丽霏;敖永华;张立军;;大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略[J];生物技术通讯;2013年04期
6 高钰双;冯甜;邱景富;杨瑞馥;周冬生;李迎丽;;肺炎克雷伯菌基因无痕敲除方法的建立[J];军事医学;2013年06期
7 王力;申静;孟令兵;;环己酮生产废水处理新工艺[J];河南化工;2013年07期
8 张丽丽;李振军;李景富;王傲雪;;融合基因构建方法的建立[J];东北农业大学学报;2012年01期
9 徐明;路铁刚;;植物诱变技术的研究进展[J];生物技术进展;2011年02期
10 陈国梁;白兴俊;赵蓉;雷鸿亮;陈宗礼;;PCR构建融合基因方法的建立[J];生物技术通报;2010年08期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李鑫;李亚芯;戴建君;;Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用[J];中国畜牧兽医;2017年07期
2 常海斌;侯占铭;;关于基因敲除技术的浅介[J];考试周刊;2017年42期
3 何思雨;成文玉;金红星;;S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响[J];生物技术通报;2017年08期
4 肖丽生;祁芝珍;吕瑞辰;宋凯;陈荣;王敏;吴海莲;赵海红;宋亚军;;鼠疫耶尔森菌基因组无痕修饰方法的建立[J];军事医学;2017年03期
5 陆浩;李天明;刘金雷;杜红燕;王北辰;冯惠勇;;基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建[J];食品科学;2017年04期
6 魏解冰;狄少康;文江祁;庞永珍;;植物Tnt1反转录转座子突变体库的特征及应用[J];植物学报;2016年06期
7 廖晓英;阎晋东;钟鸣;卓宇红;吴丹;贺热情;赵小英;刘选明;;甘蓝型油菜EMS诱变及多分枝和长角突变体分析[J];生命科学研究;2016年05期
8 肖熙鸥;林文秋;李威;刘国强;张晓虹;吕玲玲;;利用EMS进行茄子种质资源创新[J];南方农业学报;2016年08期
9 曾文浩;孔慧;屈保平;张美龄;王咏枝;闫昕;赵琰;屈会化;;利用免疫亲和色谱柱特异性敲除甘草酸的方法学研究[J];中草药;2016年16期
10 陈松笔;安飞飞;张振文;叶剑秋;欧文军;肖鑫辉;李开绵;;木薯综合育种理论探讨[J];生命科学;2016年07期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 仉英;田月如;艾芙琪;刘红;马逸珉;王蓓;蒋晓飞;;同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌质粒bla_(KPC-2)基因[J];检验医学;2014年06期
2 韩朋;孙琦;赵素慧;张其威;万成松;;肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株的构建及其生物学特性分析[J];南方医科大学学报;2014年06期
3 陈振鸿;王丽;张义全;冯娇;杨瑞馥;常德;安莉;刘长庭;周冬生;;副溶血弧菌基因回补实验方法的建立与应用[J];南方医科大学学报;2014年01期
4 高钰双;冯甜;邱景富;杨瑞馥;周冬生;李迎丽;;肺炎克雷伯菌基因无痕敲除方法的建立[J];军事医学;2013年06期
5 肖水华;洪钦阳;林燕珍;李今煜;;基因敲除技术在芽胞杆菌中的应用研究[J];生物技术进展;2013年02期
6 莫隽颖;陶冶;周佳佳;高黎荣;付水林;宫衡;;Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌中的应用研究[J];化学与生物工程;2011年08期
7 刘霞;高鹤;杨琳;张义全;谭亚芳;郭兆彪;黄新祥;杨瑞馥;周冬生;;副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用[J];中国实验动物学报;2011年03期
8 于慧敏;马玉超;;工业微生物代谢途径调控的基因敲除策略[J];生物工程学报;2010年09期
9 陈国梁;张金文;王蒂;陈宗礼;杨波波;;重叠PCR一步法对三种淀粉合成酶融合基因的构建[J];甘肃农业大学学报;2010年03期
10 田野;曹雪松;;植物基因沉默的研究进展[J];聊城大学学报(自然科学版);2010年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 纪莉;填充柱气相色谱法测定环己胺及其杂质[J];甘肃科技;2002年09期
2 史保川,孙培培,刘维俭,顾林玲,张永;γ-环己胺丙基硅烷偶联剂的合成[J];南京师大学报(自然科学版);1999年01期
3 姜莉,杨永杰,韩建勋,宋连军,国振双;灰色系统理论在环己胺基磺酸钠合成条件分析中的应用[J];齐齐哈尔师范学院学报(自然科学版);1997年01期
4 张静,孙润广,齐浩;脂肪酸环己胺合铂结构及抗肿瘤作用研究[J];光子学报;2002年12期
5 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 文三;张小芹;刘良红;;1,1'-过氧化双环己胺合成及表征[A];加入WTO和中国科技与可持续发展——挑战与机遇、责任和对策(下册)[C];2002年
2 李培儒;;环己胺生产工艺技术及催化剂应用[A];第1届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2004年
3 栗建林;刘建中;崔明珍;宋景平;张鹏;张丽帼;季永平;;工作场所空气中环己胺卫生标准研制[A];新世纪预防医学面临的挑战——中华预防医学会首届学术年会论文摘要集[C];2002年
4 赵建安;王元生;;JH-1型苯胺加氢制环己胺催化剂活化问题探讨[A];第四届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2007年
5 谢素娟;牛雄雷;刘盛林;王清遐;徐龙伢;;ZSM-35分子筛的放大合成[A];第三届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 孟晖;环己胺要加快发展步伐[N];中国化工报;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 吕养心;环己胺的合成研究[D];浙江大学;2005年
2 裘国俊;环己胺与甲醇催化合成N,N-二甲基环己胺[D];天津大学;2005年
3 李存治;假单胞菌NyZ12中环己胺氧化酶基因的克隆、表达与纯化[D];武汉轻工大学;2016年
4 毛灵琪;环己胺降解菌NyZ12胺氧化酶基因敲除突变体的构建及特性研究[D];武汉轻工大学;2016年
5 兰玉坤;几种有抗Ⅱ型糖尿病作用的酪氨酸衍生物的合成与分析[D];重庆大学;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026