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《武汉轻工大学》 2016年
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几丁质酶高产芽孢杆菌的筛选及基因克隆与表达

程德勇  
【摘要】:本研究从武汉土壤中筛选出了六株产几丁质酶的芽孢杆菌。通过16S rRNA基因分子鉴定,确定其中4株(D1,D2,D3和D4)为Paenibacillus illinoisensis,另外2株(CDY-607和W1)为解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus),以解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607为出发菌株获得研究结果如下:解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607几丁质酶发酵液最适反应温度为55℃,最适反应pH值为6.5和8.0,金属离子Fe2+对几丁质酶酶活力有促进作用。对解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607产几丁质酶发酵培养基配方及培养条件进行优化,结果表明CDY-607产几丁质酶最佳发酵时间为96 h,最佳接种量为5%,最佳装瓶量为100 mL,最佳培养基pH值为6.5。产几丁质酶最适发酵培养基配方为胶体几丁质5 g/L,硫酸亚铁2 g/L,蛋白胨2 g/L,酵母膏5 g/L。在最适条件下测定的发酵液酶活力(49.26 mU/m L)是未优化发酵培养基发酵液酶活力(24.62 mU/m L)的2倍。在PCR扩增获得解木聚糖类芽孢杆菌CDY-607几丁质酶基因部分保守片段后,通过Tail-PCR成功扩增出几丁质酶基因两侧DNA片段。拼接后发现几丁质酶基因长996 bp。该基因只含有一个第18糖苷酶家族催化结构域。编码该结构域的序列大小为912 bp,共304个氨基酸,预测编码的蛋白质分子量大小为33.42kDa。将该基因与载体p FLAG-CTS重组后于大肠杆菌DH5a中分泌表达,经IPTG诱导培养12 h后,采用DNS法测定培养液几丁质酶酶活力为17 mU/m L。此外,SDS-PAGE亦成功检测到分泌表达的几丁质酶,大小在33.4 kDa左右,与预测结果相符。
【学位授予单位】:武汉轻工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78;Q93

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