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《武汉轻工大学》 2016年
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壳青霉内切纤维素酶结合位点的研究

熊炜  
【摘要】:纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称,它们协同作用分解纤维素产生寡糖和纤维二糖,最终水解为葡萄糖。在结构上,纤维素酶由催化结构域(CD)、结合结构域(CBD)组成,两个结构域由连接肽(Linker)相连。纤维素酶在水解纤维素的过程中,首先需要结合结构域与纤维素吸附将其固定,而后催化结构域才能将其水解。本实验室前期筛选得到一株能水解纤维素的壳青霉Penicillium sp.601,并通过反转录获得其内切纤维素酶基因EGLI。随后的研究发现其结合结构域具有较强的纤维素结合能力,催化结构域具有较弱的结合能力。本课题旨在研究壳青霉内切纤维素酶催化结构域(EGL1 CD)和结合结构域(EGL1 CBD)的催化活性以及与纤维素结合活性之间的相互关系。关于EGL1 CBD的研究,根据与已报导的纤维素酶比较,发现EGL1 CBD有两个芳香族氨基酸富足区(前区M1和后区M2),为了进一步确定结合位点的位置,我们将EGL1 CBD两个区的芳香族氨基酸分别突变成甘氨酸,形成四种突变体基因。将四种突变体基因与对照egfp-CBD,egfp在大肠杆菌中表达,纯化后得到空白蛋白eGFP,对照蛋白eGFP-CBD,突变体蛋白eGFP-CBD-2R(3位点突变,M1区)、eGFP-CBD-3R(6位点突变,3位点位于M1区,3位点位于M2区)、eGFP-CBD-4F(3位点突变,位于M2区)、eGFP-CBD-5F(1位点突变,位于M2区)。用荧光显微镜观察6种蛋白与纤维素结合后的情况,根据荧光信号判断结合情况如下:eGFP-CBDeGFP-CBD-5FeGFP-CBD-4FeGFP-CBD-2ReGFP-CBD-3ReGFP。用等温滴定微量量热仪检测蛋白与纤维五糖的吸附热,吸附实验结果与结合实验结果一致,即前区氨基酸对结合功能的贡献率大于后区。同源模拟EGL1 CBD的三维结构,前后区氨基酸在同一平面,协同参与结合纤维素,前区在空间结构上作为与全酶分子的接头区,这可能是导致前、后区贡献率不同的原因。关于EGL1 CD的研究,根据对CD序列的模拟和参考CBD的研究结果,我们突变CD结构底部的Tyr154、Phe156和活性位点附近的Trp166、Trp168突变为甘氨酸,将得到的突变基因与CD分别在大肠杆菌中表达,得到蛋白CD、CDM1(W_(166),W_(168))、CDM2(F154,Y156)和CDM3(W_(166),W_(168),F154,Y156)。将得到的四种蛋白水解滤纸,发现水解滤纸能力:CDCDM2CDM1CDM3,根据突变位点的结构位置推测底部的芳香族氨基酸F154、Y156参与CD与纤维质的固定,活性位点附近的芳香族氨基酸W_(166)、W_(168)可能参与纤维素的传输。本研究为纤维素酶结构与功能的后续研究提供理论性基础。
【学位授予单位】:武汉轻工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q55

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