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酶解法制备特定重均分子量及窄分布壳寡糖的工艺研究

胡瑞  
【摘要】:壳聚糖由于相对分子质量大、水溶性差,导致其生物利用度较低。相比而言,壳寡糖则具有良好的水溶性,生物利用度高。壳寡糖具有许多有价值的生物活性,包括抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗炎、调节血脂和血糖、增强免疫、活化肠道菌群等。 壳寡糖的分子量与其生物活性密切相关。有报道称聚合度在6左右的壳寡糖相对于其他分子量壳寡糖抗肿瘤作用更强,因此通过控制降解反应条件及降解程度获取特定分子量的壳寡糖产品显得尤为重要。生产实践中采用的壳聚糖降解方法主要有以下三种:生物降解法、物理法和化学法。相较于后两种方法,生物降解法具有耗能少、降解效率高、反应条件温和、环境污染小且反应条件可控等优点,是目前生产壳寡糖的常用方法。本文通过控制酶解反应条件以及酶解反应时间,获得特定重均分子量的壳寡糖,再配合膜分离方法,运用不同截留分子量的膜材料,进一步缩窄壳寡糖分子量分布并提高产品纯度。在壳寡糖产品质量控制方面,本文运用凝胶渗透色谱法(GPC),方便快速地获取壳寡糖分子量及分布情况。 本文研究了由蜡状芽孢杆菌发酵制备所得壳聚糖酶的酶学性质,包括温度、pH、金属离子对壳聚糖酶活力的影响;环境温度、体系pH对壳聚糖酶稳定性的影响。结果表明,壳聚糖酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为45℃,最适酶底比为1:10(1mL壳聚糖酶对应10g壳聚糖底物),酶解反应底物浓度控制在3%到5%(质量分数)之间。该壳聚糖酶在pH4-8之间,体系温度40℃以下能够保持酶活力的相对稳定。Fe3+、Ba2+、Ca2+对酶活力有促进作用,A13+、Cu2+对酶活力有明显的抑制作用,Pb2+、Mg2+、Zn2+对酶活力无明显影响。向壳聚糖底物胶体溶液中加入酶液10min后,通过旋转黏度计测定酶解反应液动态黏度值发现,体系黏度显著降低并趋于稳定,结合产物质谱分析可以推测,该壳聚糖酶具有优良的内切降解效果。通过电子pH计监控反应液体系pH变化,结果显示,体系pH随着反应进行无明显变化,这说明壳聚糖具有缓冲作用,能够维持体系pH的相对稳定。通过对比壳聚糖底物及降解产物的红外图谱可以发现,降解前后相关物质各特征官能团的红外吸收无明显变化。本文还考察了现代膜分离技术在壳寡糖生产工艺中的应用,研究了卷式超滤膜、纳滤膜在壳寡糖除杂及浓缩纯化工艺中应用的可行性。对膜分离设备运行情况的考察结果表明,超滤和纳滤能缩窄产物分子量分布及提高产物纯度和浓度。最后产物分子量测定采用GPC方法。液相色谱条件:凝胶渗透色谱柱PL aquagel-OH30串联色谱柱PLaquagel-OH MIXED μm300X7.5mm;柱温:30℃;流动相:醋酸-醋酸钠(0.1mol/L1:1);流速:1.0mL/min;进样量:20μm;使用示差折光检测器检测;Agilent GPC软件分析处理。通过质谱分析验证发现该方法可靠性较好。运用GPC法测定不同酶解时间产物分子量数据可以指导生产实践中通过控制酶解时间制各特定分子量的壳寡糖产品。


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