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《武汉理工大学》 2006年
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四氨基金属酞菁-Fe_3O_4纳米复合粒子固定化漆酶及其在光纤肾上腺素传感器中的应用

肖海燕  
【摘要】: 有机—无机纳米复合材料是无机纳米粒子和有机物在纳米尺度上复合而成的新型材料,将这类材料应用于生命和信息科学领域,是一个非常吸引人的研究方向。本学位论文根据光纤生物传感器和临床医学检测存在的主要问题,利用有机—无机纳米复合技术和酶固定化技术,制备了有机-无机纳米复合粒子固定化酶,并将其应用于基于酶催化的耗氧型光纤传感器,实现了人体中非常重要的神经递质肾上腺素的检测。 本学位论文在以下几个方面进行了系统的研究。第一,选择四氨基金属酞菁(MTAPc,M=Cu,Co)和Fe_3O_4纳米粒子制备了有机—无机纳米复合材料,研究了它们的结构与性能,尤其是作为载体材料的性能。第二,研究了血红密孔菌漆酶的催化性能,并以MTAPc—Fe_3O_4纳米复合粒子为载体固定了漆酶,研究了固定化的最优化条件和固定化漆酶的性能。第三,研究了漆酶催化肾上腺素的机理和漆酶—介体体系中漆酶催化肾上腺素的机理,测定了固定化漆酶催化肾上腺素的最适条件。第四,制备了光学氧传感膜,设计和构建了基于漆酶催化的光纤肾上腺素生物传感器,研究了传感器的原理和使用条件,对肾上腺素进行了检测。 本论文的主要结论包括以下几个方面: (1)采用化学共沉淀法制备了平均粒径为10nm的Fe_3O_4纳米粒子,合成了两种MTAPc(M=Cu,Co),利用原位复合法制备了MTAPc—Fe_3O_4纳米复合粒子。用IR、XRD、XPS、SEM和粒径仪对纳米复合粒子进行了表征,表明形成了MTAPc以分子分散层包覆在Fe_3O_4纳米粒子表面的复合粒子。纳米复合粒子的磁性能、热稳定性、抗氧化能力、溶解性能、贮存稳定性的研究结果表明,MTAPc包覆层大大提高了Fe_3O_4纳米粒子的稳定性。MTAPc—Fe_3O_4纳米复合粒子的磁性能、比表面积、孔径、稳定性等性质,表明它们适合用作载体固定生物活性分子。 (2)以ABTS为底物研究了血红密孔菌漆酶的催化性能,在酒石酸缓冲溶液中它的最适催化pH值和温度分别为3.0和55℃,米氏常数Km值为12.6μM,这说明血红密孔菌漆酶是一种催化性能较好的漆酶。用UV光谱和循环伏安测试研究了漆酶催化肾上腺素氧化的机理,催化反应的最终产物是肾上腺素红,最适催化pH值和温度分别是5.0和50℃,最适缓冲液浓度为0.1M,Km值为37.5μM。在漆酶—ABTS介体体系中,游离漆酶催化肾上腺素氧化的机理研究表明催化反应是由四个化学反应组成的,肾上腺素红的生成速度不仅与每个反应的速度常数有关,还与漆酶、介体、底物的浓度有关。UV光谱表明,加入介体以后,肾上腺素红的生成速度明显提高。 (3)CuTAPc-Fe_3O_4纳米复合粒子和CoTAPc-Fe_3O_4纳米复合粒子做载体时,不参与漆酶的催化反应,固定化反应最优条件是相同的。用共价交联法固定了漆酶,固定化反应是四步的过程,对100mg复合粒子,最优条件分别是:戊二醛活化反应pH值6.0,反应时间4h,戊二醛用量0.2g;牛血清白蛋白(BSA)交联反应pH分别是8.0和6.0,BSA用量2.5mg;漆酶交联反应pH 5.0,温度0℃,反应时间1h。以2mg/mL漆酶磷酸缓冲液进行固定,漆酶的固定化率可达到20%;ABTS为底物时,固定化漆酶的催化能力是1430U/g,固定化漆酶的Km值为23.8μM。以ABTS为底物,固定在CuTAPc-Fe_3O_4纳米复合粒子和CoTAPc-Fe_3O_4纳米复合粒子上的固定化漆酶的最适催化条件相同,分别为pH值3.0,温度是45℃。弱酸性条件下固定化漆酶催化肾上腺素的反应产物是肾上腺素红,最适催化pH和温度分别是5.0和55℃;在漆酶—介体体系中,pH 5.0时固定化漆酶催化肾上腺素的最终产物随肾上腺素浓度不同而不同。 (4)采用包埋法用醋酸纤维素(CA)固定钌(Ⅱ)—联吡啶制备了光学氧传感膜,制备的最优条件是成膜温度为15—25℃,最佳配比为:0.10g CA,3.5mL丙酮和0.2 mL水,指示剂浓度8 mg/mL。光学氧传感膜对溶解氧浓度检测的传感特征曲线表明tanφ_0/tanφ与溶解氧浓度存在较好的线性关系;光学氧传感膜的检测下限为0.5mg/L,响应时间t≤60s,具有较好的重复性和稳定性,但光学氧传感膜的使用温度不能超过40℃。 (5)设计和构建了基于荧光猝灭效应的光纤肾上腺素生物传感器测试系统,以固载在CuTAPc-Fe_3O_4纳米复合粒子上的固定化漆酶为催化剂,ABTS为介体,研究漆酶—介体体系滞后相移曲线的变化。在光纤肾上腺素生物传感器中固定化酶的活力、ABTS的浓度都对肾上腺素的检测范围有影响,选择适当的固定化酶活力、介体浓度可以测定不同浓度的肾上腺素。实验表明光纤肾上腺素生物传感器的检测范围在1.0×10~(-5)—2.0×10~(-9)M,检测下限为2.0×10~(-9)M,响应时间在20-30s左右,具有较好的重复性和长期稳定性,使用温度不高于40℃。该传感器可满足对人体中低浓度肾上腺素检测的要求,具有较好的应用前景。
【学位授予单位】:武汉理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:TH789

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