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《湖北工业大学》 2018年
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黄曲霉毒素B_1降解酶及其降解机制研究

田尔诺  
【摘要】:黄曲霉毒素(Aflatoxins)是黄曲霉和寄生曲霉产生的一类次级代谢产物,黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)是目前所发现的毒性最强的真菌毒素之一,分布广泛,对人畜具有致癌、致畸、致细胞突变性。本研究利用夏孢生枝孢(Cladosporiumuredinicola)的代谢产物降解黄曲霉毒素B_1,分析了玉米芯粉高效提升代谢产物降解AFB_1酶活的原理,研究了AFB_1降解产物的结构与毒性,分离纯化AFB_1降解酶并初步探究其酶学特性。具体研究内容如下:(1)玉米芯粉培养基能提升夏孢生枝孢发酵上清液AFB_1降解酶酶活,分析了碳源对夏孢生枝孢发酵及AFB_1酶解反应的影响。玉米芯粉经高温处理后水解产生糠醛、香草醛等一系列衍生物。100μg/mL糠醛可以将AFB_1的降解酶酶活提升约100%,80μg/mL香草醛可以将AFB_1的降解酶酶活提升约85%;糠醛能使AFB_1降解酶酶活降低约30%,香草醛能使AFB_1降解酶酶活降低约20%。说明这些衍生物可以诱导夏孢生枝孢产生多种AFB_1降解酶,AFB_1多个位点被同时降解,发酵上清液AFB_1降解酶酶活明显提升。推断这些AFB_1降解酶的主要催化AFB_1分子上的呋喃环和苯环。(2)夏孢生枝孢在察氏培养基中发酵后的发酵上清液降解AFB_1得到了两种降解产物P1和P2,对两种降解产物进行了结构表征。经高分辨液质联用(LC-Q-TOF MS)和串联质谱(MS/MS)分析,P1和P2的分子量分别为406和342,分子式分别为C_(19)H_(18)O_(10)和C_(18)H_(14)O_7,P1和P2在AFB_1的分子呋喃双键部位通过加成或氧化反应产生了新的支链。(3)通过软件模拟分析和细胞毒性试验表明,两种降解产物的毒性相较于AFB_1的毒性要低。利用TEST软件进行了理论毒性预测发现大鼠半致死剂量是29.01mg/kg,P1的大鼠半致死剂量为102.5mg/kg,而P2大鼠半致死剂量为26.48mg/kg;利用细胞毒性试验,将的AFB_1、P1、P2以10μg/mL加入到细胞培养基中,发现AFB_1处理后的细胞强烈的弥漫性坏死和细胞核固缩,而P1和P2处理的细胞并未有明显的坏死情况。说明P1和P2的毒性比AFB_1低,推测P2是P1形成过程中的中间代谢产物。(4)将夏孢生枝孢发酵上清液收集冻干浓缩,分离纯化,得到两种AFB_1降解酶(E1和E2)。经过SDS-PAGE初步推断E1和E2分子量分别在65kD和30kD左右。E1和E2的最适反应温度为45°C,最适反应pH为7.5和7.0,Km值分别为44.89μg/mL和42.908μg/mL,最大反应196.0784ng/min和125ng/min。E1可以催化呋喃环和苯环,E2主要催化呋喃环,通过2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)检测E1极有可能是一种过氧化物酶。
【学位授予单位】:湖北工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TQ925

【参考文献】
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