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《华中农业大学》 2010年
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幽门螺杆菌基因敲除方法的建立及其应用研究

韩秀萍  
【摘要】: 目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一种革兰氏阴性的微需氧菌,他定植于胃黏膜上皮细胞的表面,以及胃小凹内黏液深层。大量流行病学的研究调查显示:全世界约有一半的人口中存在H. pylori的感染,它与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤以及胃腺癌等疾病的发生有关联。大量研究也证实,多个H.pylori的毒力因子直接或间接地参与了上述的病理反应,大部分主要集中于研究CagA, VacA,UreB等毒力因子的研究方面,并且在H. pylori致病过程中也可能还存在其他重要的毒力因子。本研究旨在通过建立H. pylori体内基因敲除方法来筛查新的H. pylori致胃病相关蛋白,并对其进行基因改造和分析评价,以及对其致病机制进行进一步研究。 方法与结果:第一部分,我们选择cagA,hp0596作为候选基因,从H. pylori 26695基因组中分别扩增得到此研究所需基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的氯霉素抗性基因片段共同构建突变载体;以突变载体为模板扩增打靶片段,将其转化入H.pylori26695,在抗生素选择压力下,打靶片段和H. pylori菌体基因组发生同源重组,通过氯霉素抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌转化子,并通过一系列的实验建立了在幽门螺杆菌中进行基因打靶的技术方法。确定了实验研究过程中的几个关键点,如打靶质粒的浓度、高效的电转化条件、所用抗生素的浓度和突变株的筛选培养方式,建立了相对高效的基因打靶的方法。在此基础上我们成功地对cagA, hp0596基因进行了敲除,并在基因组水平、RNA水平和蛋白质水平进行了验证。 第二部分,为避免H. pylori重组菌株对抗生素选择压力的依赖,我们利用反选择标记sacB基因在幽门螺杆菌中建立了无痕敲除系统,即通过体内基因敲除的方式构建了打靶载体,并对其生长表型作了综合评价分析。具体而言,我们选定ureB基因作为我们进行基因敲除的目标,利用同源重组原理,成功敲除了幽门螺杆菌中ureB基因,并且结合反选择系统sacB基因的作用,得到不含抗性标记的突变株H.pylori26695(AureB)。研究表明与野生菌株相比突变菌株尿素酶的功能缺失,这样通过正负两步置换选择法在幽门螺杆菌中建立了体内基因无痕敲除的方法。 第三部分,构建穿梭载体,实现Salmonella的肠黏附素蛋白在HPSS1株外膜蛋白上的表达。利用λRed系统将穿梭质粒pHH43进行改造,将菌蜕基因genE及其上游的温度敏感型启动子和下游的cat抗性基因,通过同源重组的方法置换为Salmonella的肠黏附素操纵元1pfABCDE,并将筛选基因替换为卡那霉素抗性基因。将改造好的质粒转化入HPSSl株中,实现黏附素1pfA蛋白在外膜的表达,并开展后续的鉴定工作。 结论:在幽门螺杆菌中建立了高效的体内基因重组方法,证明此方法对研究分析幽门螺杆菌的功能是最有力的工具。并且利用λRed系统成功构建改造了E. coli-H.phlori穿梭表达载体,实现了lpfA蛋白在外膜的表达。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.5;Q78

【引证文献】
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【同被引文献】
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