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《华中农业大学》 2010年
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Bacillus pumilus CN8菌株高效降解猪血Hb酶的分离纯化与降解机制探讨

李浩丽  
【摘要】: 我国是畜禽血液生产大国,原料血液难保存,畜禽血液的综合利用效率不高。利用微生物降解畜禽血液,投入低,能耗省,蛋白质、肽和氨基酸含量高,是血液综合利用的一个方向。Bacillus pumilus CN8菌株是本课题组多年筛选与选育的一株具有高效降解猪血血红蛋白能力的菌株。 Bacillus pumilus CN8菌株的发酵液,经10000 r/min冷冻离心15 min,取上清液得到粗酶液,再经硫酸铵盐分步盐析,盐析时先将硫酸铵的饱和度增加到40%,去除大部分杂蛋白,然后将饱和度调到60%。冷冻离心收集沉淀,将沉淀溶解后用透析袋进行透析,再经过DEAE-Cellulose-52离子交换层析等步骤获得电泳纯级的蛋白酶。与粗酶液相比,纯化后得到的蛋白酶比酶活达686.66 U/mg的蛋白酶,纯化倍数为13.2,回收率为35.0%。SDS-PAGE测得其分子量大约为86.92 KDa。 通过对酶学性质展开研究,得到以下结论:粗酶与纯酶的酶学性质接近,该酶的最适作用pH值为7.3,最适反应温度为42℃,在pH 6.5-9.5时能保持较高的酶活力,属于典型的中性蛋白酶;从稳定性来看,该酶在pH 6.5-9.5范围内酶活比较稳定;在30-45℃比较稳定。不同金属离子对酶活的影响是不同的。K+对酶活有显著的激活作用,Cu2+、Mn2+、Sn2+、Cd2+浓度过高和过低时均对Bacillus pumilus CN8蛋白酶的酶活有抑制作用,且随着这些金属离子浓度的增大,对该蛋白酶酶活的抑制作用也越大。Zn2+在较低浓度下对酶活的影响不是很大,随着浓度的增大,对酶活的抑制作用略有增强。Fe2+、Na+、Ca2+、Mg2+等对蛋白酶无激活或抑制作用。K+、Mg2+对酶活力具有保护作用。甘油对于酶活具有抑制作用。吐温80对蛋白酶的活性几乎没有影响,司班20和吐温20对蛋白酶的活性有促进作用。 Bacillus pumilus CN8菌株蛋白酶活力为1400 U/mL, Hb降解产物中即可溶性蛋白、游离氨基酸含量分别为5.02%、34.6mg/100mL, Hb的降解产率为59.12%。通过紫外扫描光谱分析得出:血红蛋白经Bacillus pumilus CN8菌株降解后在250nm-280nm之间出现了几个吸收峰,说明在降解过程中血红蛋白分解成了多肽、寡肽或氨基酸等物质,血红蛋白的分子结构发生了变化。通过傅里叶变换红外光谱分析,可以判断Bacillus pumilus CN8菌株作用于血红蛋白发酵培养基后,发酵液所含物质的成分发生了结构和某些性质的改变。氨基酸自动分析仪的测定结果也说明了Bacillus pumilus CN8菌株对猪血血红蛋白具有降解作用。血红蛋白经Bacilluspumilus CN8菌株作用后,通过SEM扫描观察血红蛋白微观结构的变化。得出:血红蛋白的粒径变得细小,蜂窝状结构消失,表面的孔洞结构不复存在,排列不再规则,说明Bacillus pumilus CN8菌株作用后,Hb的微观结构发生了根本性质的改变。 本文针对Bacillus pumilus CN8蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶水解猪血血红蛋白的动力学特征进行了较为系统的研究;以酶解初速度为评价指标,得到了三种酶的最佳反应温度与pH,其中Bacillus pumilus CN8蛋白酶的最佳温度为37℃、pH值为7.0;中性蛋白酶的最佳温度为45℃、pH值为7.3;胃蛋白酶的最佳温度为30℃、pH值为1.5。三种蛋白酶按Km值排序从小到大依次为:Bacillus pumilus CN8蛋白酶胃蛋白酶中性蛋白酶;Vmax从大到小依次是:Bacillus pumilus CN8蛋白酶胃蛋白酶中性蛋白酶。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q814

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