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《华中农业大学》 2010年
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利用天南星科凝集素构建内生工程真菌及其抗虫防病效果研究

兰楠  
【摘要】: 随着环境问题的日益凸显,大力发展绿色农业成为实现农业可持续发展的必要手段。微生物农药作为生物农药的主力军在生物防治领域越来越受到人们的青睐。植物内生菌因其生境的特殊性,为植物病虫害的防治和微生物农药的开发提供了新的思路和更为广阔的研究领域。本研究就是从油菜内生真菌中筛选到一株具有广谱抑菌活性的内生真菌毛壳菌YY-11,对其抗菌机理,在作物中的定殖范围进行了研究,在此基础之上,利用天南星科凝集素构建了具有抗虫和抗病双重功效的工程毛壳菌,用于生物防治,具体实验结果如下所示: (1)从油菜中分离到9株内生真菌,通过孢子形态学观察和18S rRNA基因序列分析对其进行了鉴定,其中有6株为链格孢菌(Alternaria alternata);一株为球毛壳菌(Chaetomium globosum);另两株分别属于镰刀菌属(Fusarium)和炭角菌目(Xylariales)。 (2)筛选到一株具有很好抑菌活性的内生球毛壳菌(YY-11),平板对峙试验结果表明该菌对立枯丝核(Rhizoctonia solani)、油菜灰霉(Botrytis cinerea)、油菜菌核(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦赤霉(Fusarium graminearum)等植物病原菌具有不同程度的抑制作用;玻片对峙镜检结果显示,在球毛壳菌(YY-11)对立枯丝核的抑制过程中,拮抗机理主要是重寄生,作用方式为侵入、缠绕、贴附病原菌生长等。 (3)通过回接分离试验,研究了球毛壳菌(YY-11)的定殖范围,结果表明YY-11寄主范围广泛,可以定殖多种重要的农作物如油菜、小麦、水稻、棉花、萝卜和玉米等,且定殖时间长,一百天后依然能够从回接苗中分离得到该菌。通过扫描电镜和透射电镜观察了YY-11与油菜幼根的互作,结果表明,YY-11菌丝可以从细胞间隙侵入寄主,并在其根、茎及叶片内定殖。 (4)利用天南星凝集素(Arisaema heterophyllum agglutinin, AHA)和半夏凝集素(Pinellia ternata agglutinin, PTA)构建了两个表达载体pCAM1301-AHA和pCAM1301-PTA,通过根癌农杆菌介导分别转化球毛壳菌(YY-11),转化子(T2、Te和P6)通过潮霉素抗性、PCR、SDA-PAGE及Western blotting分析,证明外源基因已整合到了重组菌基因组内,并可检测到PTA和AHA蛋白的表达。 (5)抗虫活性检测结果表明,回接重组内生真菌的油菜苗可以有效抑制蚜虫的生长和繁殖,从第五天开始,回接转化子的处理组,其植株上寄生的蚜虫数目均已极显著少于对照组(1%显著水平),并且这一趋势在随后的统计中一直稳定地维持,虽然中间存在一定的起伏,但是仍然维持着显著的差异(5%显著水平)。并且回接重组毛壳菌的油菜苗可以有效抵制核盘菌的侵染。 上述结果表明,内生球毛壳菌YY-11寄主范围广泛且定殖稳定,具有广谱抑菌活性。构建的重组菌具有明显的抗虫和抗病活性。因此,植物内生真菌可作为载体表达抗虫蛋白,用于病虫害的生物防治。
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