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《华中农业大学》 2010年
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dsRNA介导的番木瓜环斑病毒(PRSV)的抗病性研究

张帆  
【摘要】: 番木瓜环斑病毒病是番木瓜的第一大病毒性病害,到目前为止,还没有完全根治该病的方法,只能采取以栽培措施为主的综合防治措施。植物基因工程的发展为植物抗病毒的研究提供了一条新的途径,尤其是随着RNAi领域研究的快速发展,利用反向重复表达载体对植物进行遗传转化成为研究植物抗病毒研究的一大热点。将来源于病毒本身的基因导入病毒的植物寄主,均能够使植物获得一定的抗病性。 本研究以烟草、番木瓜和拟南芥作为实验材料,利用农杆菌介导法将外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR导入到受体材料中,并分析了转基因的抗病性,主要研究结果如下: (1)选取实验室保存的pHG12-CPIR转基因烟草和野生型烟草进行摩擦接种攻毒试验,同时设置对照处理。接种3d后观察表型,发现各个处理之间,接种叶并无明显表型变化。 RT-PCR检测结果显示,在接种PRSV后,野生型烟草中有高浓度的病毒CPmRNA的积累,而转pHG12-CPIR基因烟草中几乎没有病毒CP mRNA的积累,说明转pHG12-CPIR基因烟草中已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。 (2)选取番木瓜苗进行农杆菌瞬时表达实验,对子叶注射含有pHG12-CPIR载体的农杆菌,并设置对照。4d后子叶接种PRSV。在接种病毒7 d后对顶生新叶进行症状观察发现,不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101后,顶生新叶产生明显的枯斑且叶片有邹缩、褪绿的现象,而接种农杆菌pHG12-CPIR-GV3101后无明显表型变化。说明后者对PRSV已产生抗性。 RT-PCR检测结果显示,在接种PRSV后,不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101的番木瓜内有高浓度的病毒CP mRNA的积累,而接种农杆菌pHG12-CPIR-GV3101的番木瓜内几乎没有病毒CP mRNA的积累,说明接种农杆菌pHG12-CPIR-GV3101的番木瓜内已启动RNAi机制抑制了CP mRNA的表达。 (3)采用花浸法对拟南芥进行pHG12-CPIR载体的遗传转化,对T1代种子进行抗性筛选获得3株阳性苗。提取基因组DNA后用CP基因和NPTⅡ基因特异引物进行PCR检测均有目的扩增条带。3株阳性苗分别用pHG12-1、pHG12-2和pHG12-3表示。而后对这3株阳性苗分单株收取T2代种子。抗性筛选后进行阳性率统计发现,pHG12—1和pHG12—3 T2代种子筛选的阳性率均接近75%,说明pHG12—1和pHG12—3 T1代阳性苗为杂合体。而pHG12—2 T2代种子筛选的阳性率接近于100%,说明pHG12—2 T1代阳性苗为纯合体。对pHG12—2T2代移栽阳性苗随机取6株提取基因组DNA后用CP基因和NPTⅡ基因特异引物进行PCR检测均有目的扩增条带。 选取播种30 d的pHGl2—2 T2代阳性苗和野生型拟南芥的轮状叶进行攻毒试验。7d后对非接种轮状叶进行表型观察发现,接种了PRSV的野生型拟南芥的非接种轮状叶有变黄的特征,而接种了PRSV的转基因拟南芥的非接种轮状叶无明显表型变化。 RT-PCR检测结果显示,在接种PRSV后,野生型拟南芥中有高浓度的病毒CP mRNA的积累,而转pHG12-CPIR基因拟南芥中几乎没有病毒CP mRNA的积累,说明转pHG12-CPIR基因拟南芥中已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S436.67

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【参考文献】
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