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《华中农业大学》 2010年
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MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究

魏礼玲  
【摘要】: MYB转录因子基因是最大的植物转录因子基因家族之一,参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答,并对细胞分化、细胞周期以及植物叶片等器官的形态建成具有重要的调节作用,有着广泛的生理作用。转录因子的结构和功能已经成为植物分子生物学领域的研究热点。 通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达,是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。大多数MYB转录因子对植物类黄酮的代谢均有调控作用。近年来,MYB转录因子被证实广泛参与类黄酮代谢途径的调控。研究发现MYB转录因子参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节,其中R2R3-MYB转录因子作为调节蛋白广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控,控制植物的花色。到目前为止,几乎所有的报道与花青素合成相关的MYB转录因子均是R2R3-MYB蛋白。而新的研究发现,含有单个MYB结构域的MYB基因CPC在转化烟草中也控制了花色。深化了我们对MYB转录因子的认识,而且为我们实现人为地控制花青素的产量提供了策略。 鉴于以上思路,本研究的主要内容包括: 1、MYB转录因子EB175067干涉载体构建 本试验根据NCBI上矮牵牛的一个EST序列(EB175067)与拟南芥比对认为其为与花色发育相关的MYB类基因,在矮牵牛中克隆出这个基因,利用同源重组方法(BP反应)构建能形成发卡结构的RNAi载体。将GSTs片段整合进入载体Phellsgate2中,形成含有intron的反向重复序列,即ihp-RNA载体。目的载体启动子与终止子之间的设计为attP1-cedB-attP2-intron-attP2-ccdB-attP 1,所以BP反应后形成的表达载体即为含有iniron的目的片段的反向重复序列。 2、CPC超表载体和EB 175067干涉载体转化矮牵牛和烟草的研究 根据已经构建好的phellsgate2-EB175067,通过农杆菌介导的遗传转化方法将该干涉载体转入早花烟草中。对转化植株进行PCR检测,获得35株阳性转基因苗。 CPC超量表达载体,前人已经将其转化到烟草植株中并得到了花色变异的转化植株。因此本试验也将CPC超表载体转入矮牵牛V26中,也是为了进一步验证CPC转录因子的功能和调控机制。对转化植株进行PCR检测,获得了25株阳性转化苗,在下地的15株阳性转化苗中,有一株花色发生变化。与对照相比,花色变淡,花型变小。从前人研究和表型来看,超量表达的CPC确实引起了矮牵牛花色素的变化。 3、矮牵牛品种V26遗传转化体系的优化 通过对影响农杆菌介导的矮牵牛遗传转化的几个主要因素的探讨,研究矮牵牛遗传转化过程农杆菌侵染时间、共培养时间以及延迟筛选的时间对抗性芽产生率的影响,对其遗传转化体系进行优化。在本试验中,矮牵牛叶片侵染时间为5min,在共培养基上共培三天(不须延迟筛选),然后转入筛选培养基上培养可以明显提高矮牵牛的转化效率。
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