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《华中农业大学》 2010年
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斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究

王树云  
【摘要】:斑点叉尾鮰病毒(CCV)是最早被发现的鱼类疱疹病毒,由Fijan等从驯养的斑点叉尾鮰病鱼体内分离得到,斑点叉尾鮰是其自然宿主。CCV是一种被膜的双链DNA病毒,给国内外的斑点叉尾鮰养殖业造成极其严重的经济损失。序列分析显示斑点叉尾鮰开放阅读框ORF6和ORF10为预测的膜蛋白基因,可能参与病毒的吸附、入侵以及传播过程,因此,本文选择ORF6和ORF10两个基因进行研究,主要取得以下结果: 1、将斑点叉尾鮰卵巢细胞CCO复苏,在28℃下,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基传代培养,并以CCO来增殖斑点叉尾鮰病毒CCV,通过酚氯仿法从细胞培养液中提取CCV全基因组DNA。 2、根据CCV基因序列,设计并合成ORF6和ORF10的特异性引物,通过PCR扩增获得ORF6和ORF10全基因序列,大小分别为417 bp和456 bp;克隆至表达载体pET-32a,构建原核表达载体pET-32a-ORF6和pET-32a-ORF10;经IPTG诱导,ORF6和ORF10基因成功表达,目的条带显示的分子量大小和理论值35.4 KD和36.4KD稍有差异,目的蛋白均以包涵体形式存在。 3、纯化表达产物后免疫新西兰大白兔,制备ORF6和ORF10的多克隆抗体,Western Blot检测结果表明获得的ORF6和ORF10多克隆抗体特异性较好,且ORF10是CCV病毒粒子的结构蛋白。ORF6和ORF10多克隆抗体的中和实验表明两个多克隆抗体可以有效抑制CCV对CCO的感染,具有一定的保护作用;对于不同时相下的同一多克隆抗体浓度实验组而言,随着感染时间的加长,CCO细胞病变越来越严重,两个多克隆抗体的保护性越来越弱;对比同一时相同一浓度,ORF10多克隆抗体比ORF6多克隆抗体抑制细胞病变的能力强,推断ORF10多克隆抗体具有更好的保护性。
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