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《华中农业大学》 2010年
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肠道菌对苏云金芽胞杆菌棉铃虫杀虫活性的作用

薛妍  
【摘要】: 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)由于在生长发育过程中会伴随芽胞的形成而高效表达对昆虫具有特异毒性的杀虫晶体蛋白,被广泛应用于害虫防治上。在探讨苏云金芽胞杆菌杀虫机制的过程中,很多研究者认为昆虫肠道共生菌是杀虫活性所必须,也有研究者提出与此相反的观点,形成了百家争鸣的局面。本文以棉铃虫为供试昆虫,以棉铃虫肠道共生菌为切入点,来探究昆虫肠道共生菌在苏云金芽胞杆菌发挥毒力的过程中所扮演的角色,从而求证棉铃虫肠道共生菌是否为苏云金芽胞杆菌发挥毒力所必须。 首先,从人工饲养的普通棉铃虫肠道环境分离得到了9株细菌,其中8株革兰氏阳性球菌,1株革兰氏阴性球菌。从不同细菌出现的数量和在棉铃虫不同龄期的分布特征可以知道,3号菌出现的频率较高,2号菌和7号菌在肠道内数量较多,达到了108,2号、3号和7号菌是棉铃虫肠道的优势菌群。 其次,用灭菌的普通饲料中加入终浓度为500μg/mL的氨苄青霉素(Amp)、链霉素(Str)、利福霉素(Rif)和庆大霉素(Gen)的方法来获得无肠道共生菌的棉铃虫。通过稀释涂布法发现普通饲料饲养的棉铃虫肠道解剖液在NA平板上会有黄色、白色或者红色菌落出现,无菌饲料饲养的棉铃虫肠道解剖液在NA平板上没有菌落出现。说明无菌饲料饲养的棉铃虫肠道内没有可培养的细菌存在。通过液体富集法发现普通饲料饲养的棉铃虫肠道第二次富集液平均OD600为1.773,无菌饲料饲养的棉铃虫肠道第二次富集液平均OD600为0.004。进一步说明无菌饲料饲养的棉铃虫肠道内没有可培养的细菌存在。提取普通饲料和无菌饲料饲养的棉铃虫肠道总DNA,扩增16S rDNA,结果显示普通饲料饲养的1龄、2龄和3龄棉铃虫都有1.5kb的条带出现,无菌饲料饲养的1龄、2龄和3龄棉铃虫都没有特异性条带的出现。说明用灭菌饲料中加入抗生素的方法可以将棉铃虫肠道内细菌消除。 同时比较用普通饲料饲养的棉铃虫和无菌饲料饲养的棉铃虫的生长状态和存活率。相同条件下饲养的相同批次的不同组棉铃虫生长状态和存活率接近。普通饲料饲养的棉铃虫,3龄和6龄时的平均体重分别为38.75mg/头和223.25mg/头,平均存活率分别为90.25%和86.00%;无菌饲料饲养的棉铃虫,3龄和6龄时的平均体重分别为37.50mg/头和231.00mg/头,平均存活率分别为89.50%和87.00%。 随后,用Cry1Ac10毒素蛋白对普通棉铃虫和无肠道共生菌棉铃虫进行生物测定实验,结果表明,Cry1Ac10毒素蛋白对普通棉铃虫和无肠道共生菌棉铃虫的LC50分别为0.0579±0.0389 mg/mL和0.0143±0.0054 mg/mL,对两种品系的棉铃虫都有较高的毒力,而且Cry1Ac10毒素蛋白对无肠道共生菌棉铃虫的毒力远远高于对普通棉铃虫的毒力,是普通棉铃虫毒力的4倍。 将从普通棉铃虫肠道筛选得到编号为3号的细菌,活化后混匀到无菌感染饲料中,感染棉铃虫幼虫。结果发现,3号菌可以降低无肠道共生菌棉铃虫对Cry1Ac10的敏感性,使无肠道共生菌棉铃虫的死亡率从36.94%降低至26.92%。由实验结果可知,肠道细菌并非Bt发挥对棉铃虫毒力所必须。相反,肠道细菌能够在Cry1Ac10发挥毒力的过程中起着保护棉铃虫的作用。
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