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转Bt基因甘蓝的抗虫性研究

付雪林  
【摘要】: 本实验分别对激素、外植体类型、无菌苗培养时间及硝酸银和乙酰丁香酮浓度等影响甘蓝08J80外植体再生的因素进行了研究,建立了甘蓝下胚轴高效再生体系。利用该再生体系采用农杆菌介导法,将表达不同苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因CryIAc、CryIC分别转化甘蓝中甘8号和08J80,获得再生植株。将生根植株置于添加5 mg/L卡那霉素的生根培养基上筛选。提取筛选后存活且生长正常的植株的DNA,以目的基因为引物,进行PCR检测,获得扩增出目的基因的植株。以CryIAc基因为探针,将部分转基因植株进行Southern blot分析,证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中。提取转基因植株根、茎、幼叶和成熟叶部位的的RNA,反转录成cDNA后,再进行PCR扩增,通过RT-PCR实验以检测抗虫基因在转基因植株各组织的表达情况。室内离体叶片抗虫试验中,观察转基因甘蓝叶片和野生型甘蓝叶片的损害程度,统计幼虫校正死亡率,平均单虫重,解剖正常死亡和中毒死亡的虫体,观察其肠道的差异。本研究获得的主要结果如下: 1.建立的甘蓝下胚轴再生体系为:选取6d至7d苗龄的下胚轴,将其置于MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+AgNO3 5mg/L的芽分化培养基中,芽分化为丛生芽,频率高达80%。 2.获得的甘蓝再生植株中,转CrylAc基因的中甘8号植株369株,转CrylC基因的中甘8号甘蓝412株,转CrylAc基因的08J80750株。在不定芽生根过程中,杂交甘蓝的生根率达到60%,08J80的生根率约为10%,其中08J80甘蓝在不定芽及生根阶段玻璃化很严重。 3.在含有5 mg/L卡那霉素的生根培养基中筛选转化植株,获得转CryIAc基因的杂交甘蓝5株,转CryIC基因的中甘8号甘蓝5株,转CryIAc基因的08J80甘蓝3株。 4.PCR检测,能够扩增出目的条带的植株中,转CryIAc基因的中甘8号甘蓝4株,转CryIC基因的中甘8号甘蓝4株,转CryIAc基因的08J80甘蓝3株。阳性检测率超过90%。 5.部分转CryIAc植株的Southern blot结果表明外源基因已经整合到甘蓝的基因组中。 6.部分转CryIAc基因植株的RT-PCR结果显示,CrylAc基因在转基因植株各组织呈组成型表达。 7.室内离体叶片抗虫试验结果表明,转基因植株叶片的损害程度较轻,野生型植株叶片损害严重;啃食转基因植株叶片的小菜蛾在24h至72h时期内出现中毒死亡现象,啃食野生型甘蓝叶片的小菜蛾虫体活泼,72h后存活的昆虫生活力强,且虫体同72h之前稍大;啃食转基因植株的昆虫校正死亡率超过80%,转基因植株叶片上昆虫的单虫重同野生型叶片上昆虫的单虫重相比差异显著。解剖虫体实验结果显示,野生型叶片上死亡的虫体的肠道完整无损,无异常情况,转基因叶片上死亡的虫体肠道肿胀变粗,呈褐色,有的部位开始腐烂。这些现象说明Bt杀虫蛋白能够有效杀死小菜蛾等鳞翅目昆虫。


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