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《华中农业大学》 2010年
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T-2毒素多克隆抗体的制备及其化学发光免疫检测的初步研究

徐娟  
【摘要】: T-2毒素是镰刀菌产生的一种真菌毒素,存在于污染的小麦、玉米等谷物中,由于T-2毒素是单端孢霉烯族类毒性最强的化合物,因此对食物和饲料T-2进行快速检测显得非常重要和迫切。本论文采用CLEIA法对T-2的快速检测进行了初步研究。包括T-2人工抗原的合成、多克隆抗体制备和(competitive chemiluminescence immunoassay assays,CLEIA)法的初步建立,结果如下: 本研究采用碳二亚胺法,在蒸气浴条件下,将T-2毒素与琥珀酸酐反应,合成了T-2HS,经薄层层析显示,目标半抗原合成成功;然后将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原,并采用紫外扫描及SDS-PAGE两种方法鉴定。结果显示,偶联物分子量高于蛋白,并且紫外扫描的最大吸收峰均有所偏移,证明偶联物合成成功。然后可以从紫外扫描图谱得出,T-2毒素与牛血清白蛋白的偶联比为6.66,与卵清蛋白的偶联比为10.11,结果显示此完全抗原能够用于免疫动物,并为进一步制备T-2毒素抗体奠定了基础。 以人工抗原T-2BSA作为免疫源免疫BALB/c小鼠,经过3次加强免疫后,采用间接ELISA法检测抗血清效价,小鼠血清达到了1:12800,选取效价较高的小鼠血清进行阻断实验,结果显示104 ng/ml T-2毒素对T-2BSA抑制率为90.71%,103ng/ml T-2毒素对T-2BSA抑制率为3.54%。 取未免疫的小鼠血清作为阴性对照,倍比稀释(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:64001:12800)免疫血清,同时包被不同浓度的包被抗原进行方阵法实验,结果表明,T-2OVA抗原最佳包被浓度为20μg/ml,最佳抗体稀释度为1:4000,同时得到以T-2OVA抗原免疫得到的小鼠的血清效价在1:4000时,其OD450值均大于1.0且阳性血清与阴性血清的比值大于2。 对CLEIA免疫检测方法进行评价,其IC50值为0.162μg/ml,检出限为0.003μg/ml。相比于ELISA免疫检测方法进行,IC50值为0.794μg/ml,检出限为0.019μg/ml。可以得出CLEIA免疫检测方法较ELISA免疫检测方法灵敏度高、操作简单、检测快速等优点,为进一步的开发研究奠定了基础。
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