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《华中农业大学》 2010年
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哈维弧菌表面抗原的克隆和真核表达

黄辉  
【摘要】: 哈维弧菌(Vibrio harveyi)是一种能产生单极端鞭毛的革兰氏阴性杆菌,是海水养殖中常见的致病菌,由其引起的弧菌病是水产养殖经济动物中最为严重的疾病之一,造成巨大的经济损失。外膜蛋白(outer membrane proteins, Omps)是革兰氏阴性菌特有的外膜的主要结构成份,在维持细菌细胞结构稳定、细胞的物质交换及细菌的致病过程中起着十分重要的作用,同时,部分病原菌的外膜蛋白有良好的免疫原性,可以刺激机体的发生免疫应答反应,可能作为疫苗的有效成份。 根据已发表的哈维弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU,测序结果表明,该基因与已发表的哈维弧菌外膜蛋白OmpU基因序列存在98%以上的相似性。该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET30(a)-OmpU后转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 kD,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以尿素法得到初步纯化的重组蛋白,以50μg/mL的剂量注射免疫大黄鱼幼鱼,经间接ELISA法检测了4~8周后特异性抗体的效价,同时检测了注射后4周的免疫保护率。结果表明,4~8周内特异性抗体效价持续升高,达到log28.0以上,4周时的相对免疫保护率为85%。试验结果显示了重组哈维弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可能作为亚单位疫苗的开发对象。 根据溶藻弧菌外膜蛋白OmpU的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从患病鲈鱼分离的溶藻弧菌zj2007株基因组中扩增获得一段约960bp的序列。测序结果证明该序列是溶藻弧菌外膜蛋白OmpU基因。PCR产物经定向克隆连接到原核表达载体pET30(a),构建重组表达质粒pET30(a)-VAOmpU,并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞,添加一定量的IPTG诱导表达,SDS-PAGE图谱检测到重组蛋白获得大量表达。Bandscan分析重组蛋白的分子量为48.49kDa,略高于预期分子量(40.49kDa)。为进一步进行溶藻弧菌OmpU的免疫原性研究打下了基础。 根据已发表哈维弧菌外膜蛋白OmpW的基因序列设计一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从患病鲈鱼分离的哈维弧菌zj2008株基因组中扩增获得一段约600bp的序列。将其克隆到pET30(a)原核表达载体,测序结果证明该序列是哈维弧菌外膜蛋白OmpW基因。将重组质粒pET30(a)-OmpW转化到大肠杆菌E.coliBL21表达菌株,经IPTG诱导后大量表达了目的蛋白;Bandscan分析重组蛋白的分子量为28kDa,与预期分子量(26.69kDa)基本相符。本研究为进一步进行哈维弧菌OmpW的免疫原性研究打下了基础。 作为真核细胞,在毕赤酵母中表达中表达蛋白有这很多优点,例如,蛋白质加工,折叠和修饰。这些操作就像在大肠杆菌和酿酒酵母中一样简单。其比其他真核表达系统如杆状病毒或哺乳动物组织培养液低廉,快速,简单,并且通常能有很高的表达水平。这些优点使毕赤酵母成为一种非常实用的蛋白表达系统。 根据已知的基因序列,设计一对加入EcoRⅠ和NoteⅠ的引物,从本实验室保存的哈维弧菌zj2008的基因组中扩增出600bp左右的OmpW片段,双酶切PCR产物和pPIC9K质粒,建立连接体系,构建pPIC9K-OmpW真核质粒,经PCR,酶切鉴定,基因测序,确认连接成功后,用SacⅠ线性化重组质粒,电转化GS115酵母,经筛选、鉴定,成功获得了GS115-pPIC9K-OmpW重组菌株。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S941

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【参考文献】
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