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《华中农业大学》 2010年
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表达布氏杆菌sodc基因的重组沙门氏菌的构建及不同种布氏杆菌鉴别PCR检测方法的建立

刘新军  
【摘要】: 布氏杆菌病(Brucellosis)是由布氏杆菌(Brucella)引起的一类人畜共患的急、慢性传染病。常规布氏杆菌活疫苗因其有效性及生物安全性上的缺陷,给布氏杆菌病的防制带来隐患,开发新型安全有效的疫苗迫在眉睫。新近研究表明sodc蛋白是布氏杆菌重要的毒力因子和保护性抗原,是优秀的疫苗候选抗原。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有能有效递呈抗原、细胞免疫、诱导粘膜免疫、成本低廉、副作用低等优点。本研究将抗原基因sodc克隆至无抗性原核表达质粒,成功构建能有效表达外源抗原的无抗性重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组菌菌株的免疫效果进行初步评价,为布氏杆菌病的防治进行初步探索。我国目前所采用的虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)等有较高的假阳性,酶联免疫吸附试验(ELISA)大多数局限于布氏杆菌抗体检测。PCR检测方法具有特异性好、敏感性高等优点,而且能确实诊断是否有布氏杆菌的感染,有利于病原流行病学调查和淘汰感染动物。感染人和经济动物布氏杆菌主要有羊种、牛种和猪种布氏杆菌,牛奶是布氏杆菌病的传染源之一,因此建立快速诊断牛奶的多重PCR检测方法,对人和经济动物都具有很重要的生物安全意义。 主要研究内容如下: 1.表达sodc的减毒沙门氏菌工程菌株的构建 根据Gene-Bank中的已知序列设计引物,扩增sodc基因,然后将该片段克隆到表达质粒pYA3493中,得到重组质粒pYA-sodc。将pYAsodc和pYA3493分别电转化猪霍乱沙门氏菌C500的asd缺失株C501中,制备重组菌株C501(pYA-sodc)和空载体菌株C501(pYA3493)。SDS-PAGE鉴定和Western-blot结果表明sodc基因能够表达。研究结果表明,重组菌株C501(pYA-sodc)不仅保留了亲本菌株C500的表型特征,且能稳定遗传并分泌表达外源蛋白。将重组菌C501(pYA-sodc)分别以口服和肌肉注射途径免疫小鼠,结果显示两种免疫方法均可以诱导体液免疫反应和产生IFN-γ。 2.多重PCR的构建 参照David Garcia-Yoldi等(2006)建立的多重PCR,以P7-P12为引物建立的多重PCR, B.abortus, B.melitensis和B.suis都均扩增出目的片段,但该多重PCR却不能鉴别诊断这三个种。参照Bricker等(1994)建立的AMOS-PCR,设计引物P1-P6建立的PCR, B.abortus, B.melitensis和B.suis都能够扩增出种特异性的片段,该多重PCR可检测到93 pg B.melitensis 16 M的DNA;70 pg B.abortus 2308的DNA; 41 pg B.suis1330的DNA; 710 pg B.melitensis 16 M、B.abortus 2308、B.suis1330混合DNA;从牛奶中能检测到2.4×106 CFU/ml的布氏杆菌。沙门氏菌,链球菌,金黄色葡萄球菌都没有扩增出目的片段。而我们在16份牛奶样品(RBT检测阳性)的检测中,检测到一份牛奶样品为B.abortus和B.suis阳性。
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