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《华中农业大学》 2010年
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猪干扰素刺激基因ISG20的克隆、真核表达及其对PRRSV增殖的影响

李燕  
【摘要】: 干扰素(Interferon, IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子,其抗病毒作用是通过诱导一系列干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表达产生抗病毒蛋白而实现的。ISG20基因是新近发现的一种表达20kDa蛋白的干扰素刺激基因,表达产物具有核酸外切酶活性,能降解单链RNA及DNA,研究证实在同时敲除PKR、2’,5’-OAS及Mx三个基因的小鼠成纤维母细胞中表达ISG20能抑制水疱性口炎病毒(VSV)的增殖,说明ISG20参与介导IFN的抗病毒作用。 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是一种单股正链RNA病毒,引起猪的繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),给世界养猪业造成了巨大的经济损失。寻找有效的抗病毒基因将为抗PRRSV品系的培育和PRRS的有效预防控制创造条件,为此本研究以猪干扰素刺激基因ISG20为研究对象,对其在PRRSV增殖中的作用进行了初步探讨。主要研究内容如下: 1.猪ISG20的克隆、序列分析及其进化树的绘制 以PK-15细胞的cDNA为模板,RT-RCR扩增获得猪ISG20的编码区序列,序列分析发现该基因全长为516bp,可编码171个氨基酸残基,与GenBank上所报道的猪ISG20氨基酸序列同源性为99%,与牛、狗、人、类人猿、猴、马、小鼠、大鼠的氨基酸序列同源性分别为:91%、84%、80%、80%、78%、76%、73%、72%。系统进化树分析表明:不同物种ISG20之间的氨基酸序列同源性很高,说明ISG20在进化中是高度保守的。 2.猪ISG20结构预测与功能分析 通过蛋白质结构预测,发现猪ISG20在6-171位氨基酸之间有3个Asp(D)残基、1个Glu(E)残基和一个核酸外切酶功能域,说明猪ISG20属于DEDD核酸外切酶超家族。此外,在猪ISG20蛋白中,含45.03%的α-螺旋,24.56%的β-折叠和30.43%的无规则卷曲,这一比例符合α/β折叠蛋白的二级结构比例。以人ISG20的三级结构为模板,同源建模猪ISG20相应区段的三级结构,发现猪ISG20与人ISG20的相应结构域非常相似,这提示它的生物学功能可能与人ISG20相似。 3.猪ISG20的真核表达及其亚细胞定位分析 构建了野生型猪及核酸外切酶活性功能缺失突变型ISG20的真核表达质粒,Western blot分析证实两种质粒均能有效表达ISG20。将野生型猪ISG20基因插入pEGFP-C1下游获得ISG20与EGFP融合的真核表达质粒,转染细胞后,经激光共聚焦显微镜检测,发现猪ISG20主要位于细胞核,在细胞浆内只有少量的分布。 4.猪ISG20对PRRSV增殖的影响 运用绝对定量及TCID50分析,发现表达的野生型猪ISG20对PRRSV的增殖有显著的抑制作用,而表达无核酸外切酶活性的突变型猪ISG20对PRRSV的增殖无影响,说明猪ISG20对PRRSV的抑制作用依赖其核酸外切酶活性。 5. PRRSV感染对猪ISG20基因表达的影响 以PRRSV感染SJPL细胞,相对定量RT-PCR分析PRRSV感染对猪ISG20基因表达的影响,发现PRRSV感染SJPL细胞能显著诱导猪ISG20基因的表达,因此,我们推测宿主本身的ISG20可能在PRRSV感染过程中有一定的防御作用。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S858.28

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