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《华中农业大学》 2010年
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粘附素ClfA和Cna对金黄色葡萄球菌乳腺炎的免疫保护研究

龚瑞  
【摘要】: 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)是引起奶牛乳腺炎的众多病原中的最重要的一种病原菌,而且引起的乳腺炎存在治疗成本高、“抗性奶”和耐药菌株等问题而严重影响奶牛业和乳品业的发展。金黄色葡萄球菌表面的粘附素ClfA和Cna能够介导S. aureus粘附到宿主细胞,故在S. aureus的感染中发挥着重要作用。国内外越来越多的研究者也将粘附素作为靶抗原来开发研制新型的乳腺炎疫苗。本研究拟在以小鼠乳腺炎为模型综合评价粘附素ClfA和Cna的免疫原性、对小鼠免疫的效果及对小鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎的保护力,为研制金黄色葡萄球菌乳腺炎亚单位疫苗奠定一定的基础。 运用PCR方法扩增出临床分离的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌J9株ClfA基因,大小为1017 bp。将其与PMD 18-T载体连接,构建克隆载体。克隆载体酶切鉴定正确后采用亚克隆技术构建了重组表达质粒pET-28a(+)-ClfA,酶切鉴定及测序结果都表明获得了正确的原核表达质粒pET-28a(+)-ClfA。此外,本实验室也获得了Cna基因的原核表达质粒pET-28a(+)-Cna。将两种重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后,获得大小分别为46 kD和55 kD左右的目的蛋白;蛋白经镍离子亲和树脂纯化后,得到了高纯度的目的蛋白。用兔抗S. aureus免疫血清和鼠抗重组蛋白免疫血清,以Western blot方法分析ClfA蛋白和Cna蛋白免疫原性显示重组蛋白具有很好的免疫原性。 将纯化的蛋白及灭活的金黄色葡萄球菌J9株与白油佐剂、弗氏佐剂和SeppicISA206佐剂乳化制成亚单位疫苗和灭活疫苗,经腹腔免疫小鼠。免疫程序结束后,选取三种佐剂中血清抗体效价最高的白油佐剂免疫组进行乳腺内金黄色葡萄球菌灌注攻毒试验、免疫血清识别菌体试验、免疫血清调理中性粒细胞吞噬试验、细胞因子IL-4和IL-6含量测定及病理组织切片检测等攻毒保护力实验和免疫效果评价实验。结果显示,(1)亚单位疫苗均诱导出了高于灭活苗的IgG水平,且诱导出的IgG是以IgG1为主;(2)与PBS对照组相比,亚单位疫苗免疫组血清与金黄色葡萄球菌表面抗原结合能力更强;(3)经ClfA亚单位疫苗免疫血清调理的细菌较灭活疫苗组和PBS对照组被中性粒细胞吞噬的数量更多(P0.05);(4)攻毒后,亚单位疫苗免疫组乳腺内细菌数较对照组显著降低(P0.05)且低于灭活疫苗组;(5)亚单位疫苗疫苗能够较好地保持小鼠乳腺结构完整性及较少的多形核粒细胞浸润。 以上研究结果表明ClfA蛋白及Cna蛋白具有良好的生物活性及免疫原性,免疫小鼠产生了较好的免疫效果,且其形成的亚单位疫苗能够对小鼠乳腺炎模型提供一定的保护力,说明ClfA和Cna蛋白有望作为亚单位疫苗预防奶牛乳腺炎有效的候选抗原,本研究也能为奶牛乳腺炎亚单位疫苗的研制奠定一定的理论基础。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.4

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【引证文献】
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