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《华中农业大学》 2010年
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利用免疫磁珠技术富集肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌

王延昭  
【摘要】: 沙门氏菌是引起人类食物中毒的主要病原菌之一,对人和动物均有致病性。在世界范围内,沙门氏菌污染肉类和蛋类引起的食物中毒仍占有很高的比例。 金黄色葡萄球菌能引起多组织的感染,如引起菌血症、心内膜炎和肺炎等,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒其危害程度仅次于沙门氏菌属,是主要的食品污染细菌。 免疫磁珠是指包被有相关免疫配基(-NH2,-COOH等)的磁性微粒,利用抗原抗体反应的特异性地从混合液中分离靶物质,具有高度专一性、操作简单、不需要昂贵的仪器设备等特点。食品中沙门氏菌的检验主要用分离培养方法,由于污染量少,常规检验时必须进行增菌培养以提高检出率,因而耗时较长,检出率较低,难以在现场进行即时的快速检验。本研究应用免疫磁性分离技术及抗体制备技术,希望能从污染菌很少的样品中快速富集细菌,用集菌的方法代替增菌培养,以提高沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检出率,缩短检验时间,为市场检疫提供更为便捷的快速检验方法。 1.肠炎沙门氏菌高免血清的制备 将肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, SE)免疫原与弗氏佐剂乳化后免疫家兔和鸡,得到抗肠炎沙门氏菌的高免血清。分别经饱和硫酸铵粗提、G-200过柱纯化和辛酸-硫酸铵盐析法纯化,获得了兔抗SE和鸡抗SE的多克隆纯化抗体IgG,为应用免疫磁珠技术富集肠炎沙门氏菌方法的建立奠定了基础。 2.免疫磁珠技术富集肠炎沙门氏菌和免疫磁珠的保存 利用化学共沉淀的方法合成了磁性微粒,粒径约为30~100 nm,对其表面进行硅烷化和醛基化修饰。使用抗SE的多克隆抗体包被修饰后的磁性微粒,确定了磁珠与多克隆抗体的偶联条件。试验结果表明:使用200μL免疫磁珠与菌液作用30 min即可从样品中富集到肠炎沙门氏菌,灵敏度高达3cfu/mL。该技术要优于传统的细菌分离培养方法。 分别采取冻干法和冷藏法直接保存免疫磁珠,在不同的条件下保存一定时间后进行吸附试验,结果表明冻干法保存的磁珠吸附能力降低,故不选用冻干法保存磁珠。在直接冷藏保存组中,加保护剂的免疫磁珠吸附细菌的能力优于未加保护剂的免疫磁珠,确定了0.1‰硫柳汞与1%蔗糖混合液作为免疫磁珠的保存液。 3.免疫磁珠技术富集金黄色葡萄球菌 建立了免疫磁珠技术富集金黄色葡萄球菌的方法。试验结果表明,用100μL免疫磁珠与菌液作用15min即可从菌液中富集到金黄色葡萄球菌,敏感性高达5cfu/mL。试图将免疫磁珠技术与ELISA显色技术相结合的IMS-ELISA方法的尝试未获成功,有待今后更进一步研究。
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