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《华中农业大学》 2010年
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深海细菌Exiguobacterium Oxidotolerans A011 β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达与酶学分析

陈水莲  
【摘要】: β-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛,几乎在所有生物体中都能够找到,它们参与生物体的糖代谢,因其来源不同而性质各异,对维持生物体正常生理功能起着重要作用。研究发现,β-葡萄糖苷酶参与EMP糖酵解途径,是双歧杆菌糖代谢的相关酶系之一。在纤维素的糖化作用中,β-葡萄糖苷酶的功能是协助其它酶,将纤维二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。人和哺乳动物体内的乳糖酶/根皮苷(LPH)水解酶也含有一种芳基-β-葡萄糖苷酶,LPH因其涉及成人型乳糖酶缺乏病—一种常见的人体基因紊乱病而受到广泛关注。此外,β-葡萄糖苷酶能将瓜果、蔬菜、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质。因此对β-葡萄糖苷酶的研究具有重要的理论和实用价值。 本文从厦门海洋三所提供的海洋细菌中筛选得到一株具有较高β-葡萄糖苷酶活性的微小杆菌(Exiguobacterium oxidotolerans A011),通过鸟枪法构建文库,首次完成了该菌的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)基因的克隆以及原核表达,并对其酶学性质进行了研究。 本实验以pUC18为克隆载体,克隆得到的β-葡萄糖苷酶基因(bgl1c)全长1347bp,编码488个氨基酸,预测的蛋白分子量为51.6 kDa。该酶同其它已知p-葡萄糖苷酶的氨基酸序列的最高同源性为68%,属于糖苷水解酶第1家族。以pGEX-6p-1为表达载体,将bgl1c连在载体上,经IPTG诱导8个小时后表达良好。以pNPGlu为底物,对该酶进行了性质分析,分别测定了其最适pH值及最适温度、pH稳定性及热稳定性,以及金属离子和化学试剂对酶活的影响。Bgl1C的最适反应pH为7,在pH 6.6-9之间较稳定,最适反应温度为35℃,Na+,Ca2+,EDTA以及β-mercaptoethanol对其活性几乎没影响,而Hg+,Cu2+,CO2+则强烈抑制其活性。该酶能使纤维二糖,三糖,四糖部分降解,且同时具有较高β-半乳糖苷酶活性,是一个双功能酶。值得一提的是Bgl1C在低温时仍具较高活性,是一个冷活性β-葡萄糖苷酶。这些优良的性质使其在工业中有较高应用价值。
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