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《华中农业大学》 2010年
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柑橘黄龙病菌滚环扩增及病毒类似病原多重RT-PCR检测技术研究

刘凡  
【摘要】: 柑橘黄龙病(Citrus HuangLongBing, HLB)的病原为韧皮部杆菌属细菌(Candidatus Liberobacters),由柑桔木虱(Diaphorina citri)以及带菌接穗传播,对于该病害有效的防治方法是培育和推广使用无病毒苗木和及早发现并铲除病株,需要一套快速、准确、实用性强的黄龙病检测技术。现常用的检测方法主要是PCR检测技术,而基于锁式探针的柑橘黄龙病滚环扩增体系的研究是在PCR检测技术的基础上发展起来的一种检测技术,该方法与PCR检测技术相比在特异性及灵敏度等方面具有更大的优势。锁式探针(padlock probe)是一种独特的寡聚核苷酸单长链。由与靶序列互补的序列和链接序列两部分组成。与靶序列互补的序列在探针的两端,链接序列在中间。探针的特异性由两端的序列决定,只有在两端的序列与靶序列完全互补的时候,锁式探针即可在连接酶的作用连接成环状,在没有靶序列或不完全互补时,则锁式探针只以线性的形式存在。由于锁式探针的这种特殊的结构以及其扩增方式的多样性,使得其可用于多种检测平台。 本文根据柑橘黄龙病菌的特异性序列,按照锁式探针设计原则设计锁式探针,并根据锁式探针的链接序列设计滚环扩增的扩增引物。通过优化链接体系与程序、核酸外切酶消化体系与程序以及滚环扩增体系,建立起柑橘黄龙病菌的滚环扩增体系。以常规PCR作为对比检测其特异性,设计的滚环扩增体系只对柑橘黄龙病病菌进行特异性的扩增,对柑橘上的其他病原,如柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd)等病害均不能扩增,特异性的检测结果与常规PCR的检测结果相同。与常规的PCR检测相比,滚环扩增检测技术具有更高的灵敏度。运用滚环扩增检测体系检测到的阳性克隆质粒的浓度为100pg/μl-100fg/μl,检测下限为100fg/μl。运用常规PCR检测体系检测到的阳性克隆质粒的浓度为100pg/μl-1pg/μl,检测下限为1 pg/μl。本文建立的柑橘黄龙病滚环扩增检测体系具有良好的特异性与灵敏度,该体系的建立为我国的柑橘黄龙病的疫情动态监测与控制提供又一新的分子检测技术。 除了柑橘黄龙病以外,柑橘衰退病、柑橘裂皮病等病害也是柑橘上的重要病害,且这几种病害时常混合发生。为了达到快速,准确的检测这些病害的目的,本文在柑橘黄龙病,柑橘衰退病、柑橘裂皮病单一RT-PCR的基础上,建立起了CTV,HLB二重RT-PCR检测,并对CTV,HLB,CEVd多重RT-PCR检测体系做了优化。由于影响多重PCR的因素很多,本文在建立多重PCR检测体系时,对引物选择、扩增体系、扩增程序等多方面进行了优化。为了达到最佳的扩增效果,本文在建立CTV,HLB二重RT-PCR检测体系时主要对退火温度这一关键因素进行优化,并检测了实际样品进行验证,从20个柑橘样品中检测到10个混合侵染样品。在建立CTV,HLB,CEVd多重RT-PCR检测体系时,主要对引物浓度组合进行了优化。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S436.66

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