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《华中农业大学》 2010年
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番木瓜中SGT1、RAR1基因的克隆及其功能验证

刘国城  
【摘要】:近年的研究结果表明,RAR1、SGT1在植物的抗病信号传导过程中有非常重要的作用。但这些研究目前主要集中在传统的模式植物和重要的农作物上,作为有重要食用价值和工业价值的番木瓜,这方面的研究却少有报道。 本实验利用GenBank数据库资源建立了本地的番木瓜Genome和EST数据库;用已知的烟草、拟南芥中RAR1、SGT1基因序列,检索本地数据库,借助同源比对方法,分析出番木瓜中潜在的RAR1、SGT1基因序列,并设计引物;以番木瓜品种夏威夷(Hawaii)叶片RNA为模板,用RT-PCR方法成功克隆到番木瓜RAR1、SGT1的cDNA编码区全长。并利用反向遗传学和生物信息学的方法对克隆到的这两个基因的功能进行研究。主要获得如下结果: 1.CpRAR1、CpSGT1基因cDNA编码区全长的克隆。利用RT-PCR方法从夏威夷幼苗叶片中克隆到两条长度分别为684bp、1086bp的cDNA序列。经过与番木瓜Genome和EST数据库中序列的比对,其编码的蛋白质序列的保守结构域分析,以及与其它物种中的RAR1、SGT1基因同源性比对分析确认本实验中克隆到的这两条序列分别是番木瓜RAR1、SGT1基因,并分别命名为CpRAR1、CpSGT1。 2.CpRAR1、CpSGT1转基因拟南芥植株的获得。我们将CpRAR1、CpSGT1分别成功克隆到超表达载体pBI121上,获得4种超表达载体pBI121 pBIl21+RAR1-GUS、pBI121+SGT1、pBI121+SGT1-GUS;并将这4种超表达载体通过花序侵染法分别成功转化拟南芥(Columbia-0)。 3. CpRAR1和CpRAR1-GUS转基因拟南芥抗核盘菌分析。在获得转基因拟南芥的基础上,本实验用离体叶片接种法对CpRAR1、CpRAR1-GUS转基因拟南芥对其病原菌核盘菌的抗性变化进行了初步的分析。结果表明,超表达CpRAR1的拟南芥与野生型相比,其对核盘菌的抗性有明显提高,表现为延迟4h发病。 4.番木瓜中病毒介导的基因沉默(VIGS)实验。本实验还试图通过病毒介导的基因沉默手段研究实验中克隆到的CpRAR1、CpSGT1基因功能,并成功构建了沉默载体PTVOO+CpPDS和PTV00+CpSGT1。但在经过三次试验后,最终证实:TRV沉默表达载体不能在番木瓜中成功引起沉默现象。不过这是在番木瓜上运用病毒介导的基因沉默这一重要实验手段的首次尝试。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S667.9

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