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《华中农业大学》 2010年
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IL-6与GM-CSF基因融合表达生长抑素基因疫苗对小鼠生长的影响

赵兴华  
【摘要】: 白细胞介素-6(IL-6)是常用的免疫增强剂。为了探讨其在基因免疫中的免疫增强作用,本研究应用基因克隆、细胞培养、酶联免疫测定、RT-PCR等技术,首先克隆了牛的IL-6基因,在生长抑素DNA疫苗pGS/2SS-asd基础上插入牛的IL-6基因,构建非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-IL6-asd,并电转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌,将重组菌肌注免疫小鼠后,旨在:①探讨IL-6和GM-CSF融合表达对生长抑素DNA疫苗免疫反应和增重效果的影响;②评估其安全性,为开发安全、高效的促生长DNA疫苗,加快其临床应用奠定基础。 1.牛IL-6基因克隆和序列分析 用ConA、PHA体外刺激诱导牛外周血单核细胞(PBMC),提取单核细胞总RNA后,利用RT-PCR克隆牛IL-6基因。序列分析表明,牛IL-6基因cDNA开放阅读框为624bp,与Genbank数据库中登载的牛IL-6序列(序列号:X57317.1)进行序列比较,结果有99.84%的同源性。将牛的IL-6基因插入T载体(pEASY-T1-simple)保存。 2.非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-IL6-asd的构建与鉴定 将牛IL-6基因插入到pGS/2SS-asd质粒的下游,构建带有IL-6和GM-CSF融合表达的非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-IL6-asd。酶切、测序鉴定结果表明,基因的插入位点、方向、序列完全正确。RT-PCR结果表明,pGS/2SS-IL6-asd质粒转染细胞48h后能检测到转录产物。 3.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗pGS/2SS-IL6-asd免疫小鼠的免疫反应和促生长效果 将所构建的质粒pGS/2SS-asd电转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500,获得非抗性筛选生长抑素DNA疫苗C500(pGS/2SS-asd)。将50只雌性昆明小鼠随机分为6组,A、B、C三组分别用3种剂量(1×1010CFU/只,1×109CFU/只,1×108CFU/只)pGS/2SS-IL6-asd疫苗进行免疫;D组免疫不带IL-6的C500基因疫苗,即pGS/2SS-asd,剂量为109cfu/mL;E组免疫沙门氏菌空菌C500(109cfu/mL),F组免疫PBS。各组免疫方式均为肌肉注射,体积为0.2mL。在首次免疫后,第2周,用同等剂量的疫苗或对照液进行加强免疫一次。并分别在0(初次免疫前)、14(二免前)、28、42和56天同一时段采血。ELISA结果显示,A、B、C、D组小鼠均可以检测到抗SS抗体,且随免疫时间的延长,呈现升高的趋势。pGS/2SS-IL6-asd高剂量组和中剂量组取得了较高的抗体水平,极显著高于低剂量组和(?)pGS/2SS-asd组(p0.01)。每周称量小鼠体重,发现pGS/2SS-IL6-asd高剂量组增重效果明显高于低剂量组和(?)pGS/2SS-asd组。综上所述,IL-6和GM-CSF融合表达对生长抑素DNA疫苗有一定的免疫增强作用,pGS/2SS-IL6-asd效果要优于pGS/2SS-asd。4.染色体整合分析 将试验末期雌性昆明小鼠处死后,采集心、肝、脾、肺、肾、卵巢和肌肉组织,提取基因组DNA,PCR法检测质粒DNA的染色体整合情况。结果表明,在PCR的最大灵敏度(10拷贝/μg基因组)范围之内,没有发现质粒整合至基因组,提示即使发生整合突变,其发生频率也低于自发突变至少两个数量级。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.5

【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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6 陈永坤;糖心康对糖尿病大鼠胰腺生长抑素表达影响的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2006年
7 胡立军;生长抑素类似物奥曲肽对小鼠原位移植性肝癌和门脉转移性肝癌的抑制作用的实验研究[D];苏州大学;2004年
8 陈滟珊;生长抑素类似物对人胃癌裸鼠种植瘤生长增殖的影响[D];福建医科大学;2004年
9 陈刚;生长抑素生产过程中有机溶剂残留质量研究[D];吉林大学;2006年
10 刘欣;生长抑素DNA免疫对小鼠体组织的影响及表达产物的分布规律[D];华中农业大学;2010年
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