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《华中农业大学》 2010年
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应用酵母双杂交系统筛选与禽流感核蛋白相互作用的蛋白质

尹文偲  
【摘要】: 禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。禽流感核蛋白(nucleoprotein, NP)是流感病毒的结构蛋白,不仅在流感病毒的复制及感染方面起重要作用,还是决定病毒的宿主特异性的一个重要蛋白。NP对病毒在宿主细胞的穿梭过程也起到了决定性作用,它可以同细胞多肽如肌动蛋白相互作用,对与禽流感病毒核衣壳蛋白复合体以及相关蛋白的出核运输有较为重要的功能。为了了解禽流感核蛋白NP对病毒的转录,复制和包装的作用,以及它能和细胞内哪些蛋白相互作用,本实验应用了酵母双杂交技术筛选对禽流感核蛋白NP相互作用的蛋白。 本研究以禽流感核蛋白NP为诱饵,构建了诱饵质粒pGBKT7-NP,并对这个质粒进行了对酵母菌的毒性的检测,以及进行了自身能否激活报告基因的检测。结果表明该诱饵质粒并没有影响酵母的正常生长,同时也没有发现自激活现象,能够应用于筛选。 将此诱饵质粒转入酵母菌AH109和携带文库的Y187酵母菌进行交配,利用显微镜观测到这两种不同交配型的酵母配子体通过交配形成了二倍体。两者的结合菌使得两种不同的质粒转入了同一酵母菌株中,并且发生了一定的相互作用,报告基因被激活,表达下游基因,从而筛选到诱饵蛋白与人脑cDNA文库的靶蛋白。 营救筛选得到酵母质粒,并将这些质粒用同样的酵母转化的方法各自与pGBKT7质粒共转入酵母感受态AH109中,在用缺少腺嘌呤,组氨酸的SD培养基(SD/-Trp/-Leu)和用缺少腺嘌呤,组氨酸,亮氨酸和色氨酸的SD培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)平板上培养。在SD/-Trp/-Leu能长出1~2mm的克隆,而SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上却没有,表明筛选到的单一文库质粒不能自发激活报告基因。 通过NCBI中BLAST分析,得到了明确的蛋白序列,并从中挑选了与NP相互作的12种融合蛋白质。这12种蛋白分别为鸟苷酸调节蛋白(GNAS1), FERM和PDZ复合蛋白,转录调节因子LM04,果糖二磷酸醛缩酶C,蛋白精氨酸N-甲基转移酶1 (protein arginine methyltransferase 1),网格蛋白(clathrin), ATP酶,肽基脯氨酰顺反异构酶Pinl (protein interaction with NIMA1),锌指蛋白668(zinc finger protein 668),HIF缺氧诱发因子-1,微管相关蛋白MAP1A(microtubule-associated protein 1 A)及微管相关蛋白MAP1B(microtubule-associated protein 1B)。这些蛋白在功能上都可能和禽流感核蛋白NP存在着一定的关系。 为了进一步验证诱饵质粒和所筛选到的阳性克隆是能够发生相互作用的,我们又将诱饵质粒和各个阳性质粒pGADT7-Prey共转到酵母菌AH109中进行回复验证,并用X-gal进行显色,从而在酵母细胞中初步验证了它们的相互作用。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S855.3

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