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《华中农业大学》 2010年
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亮氨酸调节自噬的信号通路研究

朱娅琴  
【摘要】: 本试验旨在研究亮氨酸对细胞自噬水平的调节,及其调节是否依赖雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路,以及亮氨酸的信号传递到自噬相关蛋白是否必须通过mTOR上游调节蛋白中的Rheb、Raptor或GβL,为开展营养素感应的信号通路的深入研究提供策略。 本试验主要包括三部分:(1)培养人胚肾细胞(HEK 293T),进行时间梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饥饿后透射电镜观察是否产生自噬泡及其产生的规律,并运用western blot方法检测LC3-Ⅱ和p62的表达丰度变化规律。将LC3-GFP表达质粒转染至HEK 293T细胞中表达,对细胞进行时间梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饥饿后共聚焦显微镜观察荧光分布规律。(2)在0.5h,1h,2h,4h中选取自噬最明显的两个时间点(2h,4h),将细胞进行亮氨酸饥饿,以及有、无雷帕霉素(RAPA)存在条件下亮氨酸饥饿后重新补充亮氨酸,分别检测LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表达丰度。(3)运用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术分别干扰nTOR信号通路中的Rheb、Raptor或GβL表达后,在0.5h,1h,2h,4h中选取自噬最明显的两个时间点(2h,4h),将细胞进行亮氨酸饥饿及饥饿后重补充,检测LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表达丰度。 研究结果如下:(1)亮氨酸饥饿0h的细胞未观察到自噬泡,LC3-GFP的荧光弥散分布于整个细胞胞浆。亮氨酸饥饿0.5h即产生了自噬泡,LC3-GFP的荧光也由弥散分布于胞浆转变为部分聚集状态。在4h内,自噬泡和LC3-GFP的荧光聚集程度随亮氨酸饥饿时间延长而增加,4h达到顶峰。Oh未检测到LC3-Ⅱ的表达,p62的表达量是所有时间点中最高的。亮氨酸饥饿0.5h后,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P0.01),p62的表达丰度呈极显著降低(P0.01)。在4h内,随亮氨酸饥饿时间延长,LC3-Ⅱ的表达丰度呈逐渐增加趋势,4h最多;p62的表达丰度呈逐渐降低趋势,4h最少。(2)亮氨酸饥饿2h后,相对于Oh对照组,LC3-Ⅱ的表达丰度均呈极显著增加(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P0.01)。无RAPA存在时亮氨酸饥饿2h时重新补充亮氨酸,相对于饥饿0h组,LC3-Ⅱ和p62的表达丰度变化均不显著(P0.05),pS6K1的表达丰度呈极显著降低(P0.01)。相对于饥饿2h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著降低(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著增加(P0.01)。有RAPA存在时亮氨酸饥饿2h后重新补充亮氨酸,相对于0h组和无RAPA存在时补充亮氨酸组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P0.01)。相对于亮氨酸饥饿2h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度变化均不显著(P0.05)。Leu饥饿时间为4h时,LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的丰度变化趋势与2h时一致。(3)干扰Rheb或Raptor后,亮氨酸饥饿2h与饥饿后重新补充的结果相同。相对于0h组,LC3-Ⅱ的表达丰度均呈极显著增加(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P0.01)。Leu饥饿时间为4h时,LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的丰度变化趋势与2h时一致。干扰GβL后,相对于Oh组,亮氨酸饥饿2h时,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P0.01)。干扰GβL后重新补充亮氨酸,相对于0h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P0.01)。相对于饥饿2h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著降低(P0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著增加(P0.01)。Leu饥饿时间为4h时,LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的丰度变化趋势与2h时一致。 本试验研究结果表明,亮氨酸饥饿能诱导细胞产生自噬,且自噬在一定时间内随饥饿时间的延长而加剧。重新补充亮氨酸能缓解自噬,并且这种缓解作用依赖于mTOR信号通路。Rheb和Raptor是mTOR上游调节蛋白中传递亮氨酸信号的关键因子,是连接亮氨酸和细胞自噬的串联桥梁。GβL不是亮氨酸信号传递至自噬所必需的。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.2

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