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《华中农业大学》 2010年
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盾壳霉产孢相关基因的克隆及腺苷脱氨酶(CMADA)基因的初步研究

王萍萍  
【摘要】: 为了发挥盾壳霉的生防作用,有必要深入研究盾壳霉的分子生长发育、生理代谢途径及产孢调控。本研究以盾壳霉ZS-1菌株为出发菌株,在前期基础上进一步优化农杆菌介导的转化条件,将转化效率提高至50转化子/培养皿,既保证了转化效率,又可避免两个单孢萌发的菌丝长到一起,保证了转化子的纯度。通过这种方法构建了含5000个转化子的盾壳霉T-DNA标记插入突变体库。以期获得大量突变体克隆相关基因,研究基因功能。 随后我们自盾壳霉的插入突变体库中共筛选到了23株表型异常突变体,其中8株突变体在PDA平皿上完全不能产生分生孢子,10株产孢明显减少,6株产生色素异常,3株生长迅速,3株生长缓慢,2株菌丝塌陷。其中产孢缺陷型突变体在菌丝生长速度、产抗生物质、寄生菌核能力和菌落形态等方面存在差异显著性。利用反向PCR、cDNA文库等克隆基因的技术平台,克隆了5株突变体的相关基因,包括ZS-1TN29、ZS-1TN289、ZS-1TN5012、ZS-1TN5498和ZS-1TN6222,利用NCBI保守结构域数据库比较分析,编码蛋白分别推定为CMARGJ、CMGAL、CMHMGR、CMPurD、CMMAPKKK。 对突变体ZS-1TN250进行了详细研究,发现该突变体生长速度迅速,但在PDB中的生物产量比野生菌株低;产孢明显减少,后期有少量孢子产生,显微观察发现大部分孢子没有黑色素化;该突变体能寄生核盘菌,但在菌核上不产生分生孢子,致腐菌核能力显著下降;可以正常产生抗生物质。采用反向PCR技术对ZS-1TN250中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组DNA进行克隆,获得了大小为902bp的DNA片段,结合盾壳霉基因组序列分析,利用DNA MANagement软件进行全长序列拼接,得到该基因全长1522bp,包含4个外显子和3个内含子,cDNA全长为996 bp,推定编码含332个氨基酸的蛋白,T-DNA插入到第二个外显子上191nt的位置。通过NCBI BLASTP数据库,对推定编码的氨基酸序列进行分析,与adenosine/AMP deaminase family protein (Pyrenophora tritici-repentis)具有最高相似度,在蛋白水平上相似性达61%,故命名该基因为CMADA。进一步设计引物,自盾壳霉cDNA文库扩增得到3'末端。Southern杂交证实T-DNA标记在ZS-1TN250中为单拷贝。RT-PCR检测到CMADA基因在野生菌株中的积累,但在突变体ZS-1TN250中没有检测信号。用腺苷脱氨酶试剂盒测定ADA的活性,在野生菌株中可检测到该酶的活性,而突变体ZS-1TN250中未能检测到该酶的活性。因此,推定突变体表型的变化是由于T-DNA插入造成的,CMADA基因与盾壳霉的菌丝生长和孢子形成相关。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S476.1

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【引证文献】
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