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《华中农业大学》 2011年
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岷江百合原生质体的分离与培养

张宁  
【摘要】:原生质体培养及再生体系的建立在植物体细胞杂交、遗传转化及理论研究等方面具有重要的意义。岷江百合(Lilium regale Wilson)抗病性强,是重要的育种材料,可为体细胞杂交提供优良的亲本性状,其原生质体分离与培养的研究是体细胞杂交的前提。本文首先对岷江百合组培鳞茎诱导的两种愈伤组织的胚性进行鉴定,对其愈伤组织的状态进行调整,然后进行原生质体的分离与培养及其体系的优化。 岷江百合两种愈伤组织的胚性鉴定结果如下:黄色愈伤组织为胚性愈伤组织,白色愈伤组织为非胚性愈伤组织。两者特征是:黄色愈伤组织外观形态上结构紧密,有光泽,质地硬,表面有许多光滑的球形突起,易剥离;其超微结构为细胞壁薄,排列紧密,细胞间隙很小,核大,质稠,细胞器较多,液泡很小而少。白色愈伤组织外观形态上结构疏松,湿软,没有光泽,表面没有突起;其超微结构为细胞壁厚,排列疏松,细胞间隙很大且排列不规则,细胞核小,液泡很大甚至充满整个细胞。 以诱导的非胚性愈伤组织为试材,研究不同浓度的氯化钴及蔗糖对愈伤组织状态的影响。结果表明:高浓度的氯化钴(0.05 pμmol/L)和蔗糖(90g/L)有利于非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转变。氯化钻、蔗糖的浓度对岷江百合非胚性愈伤组织长势、增值系数、增殖体积的影响均达到显著性差异。较低浓度的氯化钴(0.01μmol/L)、蔗糖(30g/L)对愈伤组织的长势、增值系数及增值体积均有明显的促进作用,随着氯化钻和蔗糖浓度的增加,其长势、增值系数和增殖体积均有所降低。 以悬浮细胞或愈伤组织为材料,运用酶解法制备原生质体。在酶解过程中研究酶液中的纤维素浓度、洗液中山梨醇浓度、酶解时间和酶解方式等因素对原生质体产量的影响。结果表明:山梨醇浓度和酶解时间对原生质体产量影响均有极显著性差异。山梨醇浓度为140g/L,酶解时间为6h时分离得到的原生质体产量最高,产量最高达7.17×105个/g,活力达到70.6%。纤维素酶浓度和酶解方式对原生质体产量的影响均未达显著水平。 以制备的原生质体-酶混合液为试材,研究纯化过程中细胞筛目数、离心转速及时间对原生质体纯度的影响。结果如下:经目镜测微尺测量,岷江百合原生质体的直径大小为30-80μmm。180目是最适合岷江百合原生质体粗过滤的细胞筛目数。离心转速为300r/min,时间为4min或5min时原生质体的纯度最高。 采用液体浅层培养法将纯化的原生质体进行培养,研究培养基的糖种类及浓度对原生质体分裂的影响。结果表明:葡萄糖比蔗糖更有利于原生质体的分裂,最佳浓度为60g/L。此时,原生质体分裂最早,分裂频率最高。培养2d后,原生质体便开始膨大变形,5d后原生质体发生第一次分裂,随后发生第二次分裂,10d后,分裂形成8~16个细胞组成的小细胞团。第一次分裂频率约为5%,细胞团形成频率约为2.5%。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S682.29

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【参考文献】
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