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艳果金丝桃再生和遗传转化体系的研究

王海菲  
【摘要】:艳果金丝桃(Hypericum androsaemum L.)属藤黄科金丝桃属,是一种兼具观赏和药用价值的花灌木。其花朵鲜黄色,果实红色,观赏价值极高,在园林绿化以及插花中广泛应用。但艳果金丝桃易受到线虫和病原菌的侵害,使艳果金丝桃在自然界的生长受到影响,种质下降。本研究在艳果金丝桃组培快繁和再生的基础上,通过愈伤诱导再生和直接不定芽再生进一步完善其再生体系,并在此基础上,主要进行了艳果金丝桃农杆菌介导遗传转化的研究,目标是建立艳果金丝桃遗传转化体系,为通过基因工程实现抗性新品种的培育奠定基础。主要的研究结果如下: 1.探讨了艳果金丝桃愈伤组织诱导及再生体系 以艳果金丝桃‘Hyp4’基因型的叶片为外植体,MS为基本培养基,探讨了生长素(2,4-D, NAA, IAA, IBA)、细胞分裂素(6-BA, TDZ, KT)对叶片愈伤组织诱导的影响。结果表明:2,4-D对愈伤组织的诱导作用显著,浓度在0.5mg/L-221.0mg/L时,愈伤诱导率达到100%,IBA和NAA处理下叶片外植体没有愈伤形成;细胞分裂素6-BA, TDZ, KT单独处理对愈伤组织诱导没有显著作用;在生长素和细胞分裂素结合,通过愈伤诱导率和愈伤质量进行分析,2,4-D与KT结合愈伤组织的诱导效果较好,其中MS+2,4-D(0.5mg/L)+KT(0.5mg/L)作用下愈伤诱导率高达到90%,愈伤量大。但总体比较愈伤分化能力较低。 2.完善了艳果金丝桃直接不定芽再生体系 在前期研究的基础上,以‘Hyp3’基因型的叶片为外植体,MS为基本培养基,比较了滤纸和AgNO3在再生过程中的作用,并进一步研究了不同浓度的TDZ(0.05mg/L,0.1 mg/L,0.3mg/L)和NAA(0.0 mg/L,0.01mg/L,0.02mg/L,0.03mg/L)结合对叶片不定芽分化的影响。结果表明:1.0mg/LAgNO3在艳果金丝桃叶片不定芽再生中效果最好,再生率达到72.5%,在添加滤纸处理下再生率仅为12.5%。在激素研究中,TDZ对艳果金丝桃的叶片再生效果显著,而随着NAA浓度的升高,再生率呈下降趋势。在配方MS+TDZ (0.1mg/L)+NAA(0.0mg/L)+AgNO3(1.0mg/L)下,艳果金丝桃的再生率最高达到83.3%,平均再生芽数为3.8个,再生效果优于之前配方。 3.初步建立了艳果金丝桃农杆菌介导的遗传转化体系 以艳果金丝桃‘Hyp3’基因型为试验材料,对农杆菌介导的遗传转化进了探讨。初步确立了艳果金丝桃不定芽再生的Km选择压为20.0mg/L,抑菌剂Cef的浓度为100.0mg/L。通过GUS瞬时表达和转化后外植体生长状态分析,研究了预培养时间、侵染时间、共培养、pH缓冲剂、抗氧化剂等对转化的影响,初步得出了‘Hyp3’农杆菌介导遗传转化的基本条件:菌株EHA105,预培养时间0d.,侵染时间5min.,共培养时间3d.,共培培养基为MS+TDZ (0.1mg/L)+NAA (0.01mg/L)+AS (40.0mg/L)+MES(2.0g/L),选择培养基为MS+TDZ(0.1mg/L)+NAA(0.01mg/L)+AgNO3(1.Omg/ L)+cef(100.0mg/L)+Km(20.0mg/L).


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