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马铃薯晚疫病水平抗性相关基因StPRp27和POTHR-1的功能分析

史晓蕾  
【摘要】:马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上第四大粮食作物,在工农业生产中占有重要地位。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是马铃薯生产中最为严重的病害,在世界各地频繁发生。马铃薯对晚疫病的抗性分为垂直抗性和水平抗性,由于晚疫病原菌小种变异迅速,容易产生新的强致病力生理小种,从而由主效基因控制的垂直抗性不持久。而由多基因控制的水平抗性,属于非小种专化抗性,对不同的晚疫病生理小种都具有抗性,抗性较为持久、稳定。目前,研究人员已开展了与水平抗性相关QTL位点的定位以及差异表达基因分离、鉴定等工作,初步揭示了参与水平抗性的相关基因,并对这些基因在晚疫病菌侵染期间的表达模式以及参与的防卫代谢途径进行了研究。 在晚疫病菌诱导表达的相关基因中,病程相关蛋白基因StPRp27基因和一个与过敏反应相关的POTHR-1基因,在受到机械伤害、渗透胁迫、以及茉莉酸等处理时,均可被诱导表达。因此推断这两个基因参与了马铃薯晚疫病的防御反应,但作用机制尚不清楚。本研究通过功能分析探索其在抗性途径中的作用,取得的主要研究结果如下: 1、在本氏烟草上瞬时超量表达StPRp27和POTHR-1,同时设置阳性对照Rpi-R3a(对晚疫病生理小种99189表现垂直抗性)和Rpi-sto(对晚疫病生理小种PY23表现为垂直抗性),阴性对照为对这两个晚疫病生理小种均无抗性的R基因(abpt)。对瞬时超量表达以上基因的叶片接种晚疫病进行抗性鉴定,结果发现超量表达StPRp27和POTHR-1的叶片对不同的晚疫病生理小种的抗性均有一定的提高,初步证明StPRp27和POTHR-1基因与晚疫病抗性有关。 2、以含有R基因(Rpi-blb1或Rpi-blb2)的转基因本氏烟草和马铃薯野生种为宿主材料,利用病毒介导的基因沉默体系(virus-induced gene silencing,VIGS)分别对StPRp27和POTHR-1基因的功能进行缺失,随后通过晚疫病菌的接种鉴定以及利用R基因与病原菌效应子互作的实验证明,沉默StPRp27和POTHR-1基因后并不影响以Rpi-blb1和Rpi-blb2介导的对晚疫病抗性以及过敏反应的发生,证明StPRp27和POTHR-1所介导的抗性属于独立于主效基因Rpi-blb1和Rpi-blb2的抗性系统。 3、构建CaMV 35S启动子驱动的StPRp27超量表达载体和干涉载体,转化鄂马铃薯3号(E3)品种,对得到的转基因株系进行StPRp27表达量分析显示,超量表达株系中StPRp27的表达量明显高于对照,特异干涉转基因株系中的表达量低于对照中的表达量。选取部分转基因株系接种晚疫病原菌进行抗性评价,结果显示超量表达StPRp27基因后转基因株系的抗晚疫病能力较对照显著提高,而沉默StPRp27基因的转基因株系抗病性与对照无显著差异,证明StPRp27基因参与了马铃薯晚疫病抗性调节,其机制可能与转录后的调控有关。 4、构建pGEX-StPRp27重组载体,将该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,并对GST-StPRp27融合蛋白进行纯化,通过抑菌实验发现该融合蛋白对晚疫病菌孢子囊的萌发有一定的抑制作用,该基因可能处于马铃薯抗病信号系统的下游。构建StPRp27-GFP融合基因的表达载体,利用基因枪法转化洋葱内表皮细胞,研究结果发现,StPRp27-GFP融合基因在胞内表达,胞外和细胞壁上没有检测到绿色荧光。说明StPRp27蛋白可能在细胞内发挥抑菌作用。将用于构建马铃薯高密度图谱(UHD)的二倍体亲本材料SH83-92-488 (SH).RH89-039-16(RH)以及它们的F1代群体为材料,利用CAPS标记分别将StPRp27和POTHR-1基因定位在Ⅰ号和X号染色体上。


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