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《华中农业大学》 2011年
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猪链球菌2型感染宿主后宿主表达谱的分析研究

刘曼莉  
【摘要】:猪链球菌病是由猪链球菌(Streptococcus suis)引起的一种重要的细菌性传染病,属国家规定的二类动物疫病。猪链球菌属于革兰氏阳性菌,目前根据荚膜多糖(CPS)可将猪链球菌分为33个血清型。其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)流行最广、致病力最强,是一种重要的人畜共患传染病,能引起包括人和猪在内的多种动物的多种疾病,造成感染甚至死亡,严重影响养猪业的发展和人类健康。感染猪链球菌2型菌能引起猪的败血症、脑膜炎、肺炎等病变,并造成突然死亡人通过接触病死猪及其副产品经伤口、消化道感染猪链球菌2型,可引起人链球菌中毒休克综合症(STSS)和链球菌脑膜炎综合症(SMS),导致脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎、永久性耳聋及突发性死亡等,死亡率高。1998年夏季,在我国江苏省部分地区爆发了人感染猪链球菌病造成14人死亡;2005年夏季,在四川省的大爆发,造成204人发病38人死亡,引起了全球对公共卫生的关注。 败血症是SS2感染的常见的症状,并且能引起高死亡率。研究发现SS2可以天然寄居在扁桃体中而不发病,但是在一定的条件下SS2进入血液,被单核细胞吞噬或单独存在血液中,通过脉络丛运送到脑脊液(CSF)中,激发单核细胞或吞噬细胞产生高水平的细胞因子和趋化因子,导致该部位的炎症反应和脑膜炎。为了研究SS2感染宿主后与宿主单核细胞的相互作用,本研究选择人单核细胞THP-1细胞,采用基因芯片的方法研究SS2感染对人THP-1细胞的基因表达谱的变化。 由于SS2感染猪和人之后主要导致脑膜炎、肺炎以及败血症等病理变化,为了深入了解其致病机制,本实验选择人工感染SS2的猪脑组织、肺组织以及外周血单核淋巴细胞(PBMC)为研究对象,采用基因芯片的方法研究SS2感染后其基因表达谱的变化,为进一步研究感染机制和致病机理提供依据。具体内容如下: 1.人单核细胞系THP-1细胞感染SS2后表达谱的变化 用SS2感染THP-1细胞3h,收集对照组和实验组THP-1细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,然后在体外(IVT)合成cRNA,将cRNA片段化后与Affymetrix GenChip@系列的Human Genome U133 plus 2.0基因芯片进行杂交,通过洗片、扫描得到表达谱芯片的各探针的信号值。通过分析,得到感染了SS2的THP-1细胞的各个基因,相比较没感染SS2的THP-1对照细胞,基因的表达量是否发生了变化,以及变化的倍数(Fold Change, FC)。本实验以p-value小于或等于0.05且FC大于或等于2的基因为上调,p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因为下调。经过统计学分析,在此芯片中包含的38500个人的基因中,有2021个转录本p-value小于或等于0.05,筛选出386个转录本有显著性差异表达变化的基因,通过DAVID在线软件分析,根据Gene Ontology (GO)的注释,328个基因是已知的,包括了230个上调基因和98个下调基囚。 通过对这些基因进行Gene Ontology生物学过程(Biological process)分类,差异表达基因较多地参与下述生物学过程:翻译(Translation)、细胞因子(Chemokine)、防御/免疫反应(Defese/immunity)、泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system)、细胞分裂(Cell division)、凋亡(Apoptosis)、信号转导(signal transduction)、代谢(metabolism)、信号转导(Signal transduction)、转录(Transcription)及代谢(Metabolism)等。 利用STRING在线软件分析这些差异表达基因合成的蛋白之间的功能关系,并对一些蛋白之间的关系进行预测。我们筛选出以INSR、BCL2、CTNNB、UBE2D1和TIF2为中心的网络关系图,主要围绕在NF-kappa-B信号通路及其他免疫反应途径相关的调控网络中 进一步用实时荧光定量PCR方法对其中5个相关基因:同源盒基因(homeobox A4, HOXA4)、CC类趋化因子受体8(chemokine (C-C motif) receptor 8, CCR8)、羧肽酶O(carboxypeptidase O,CPO)、RNA聚合酶Ⅱ亚单位2(RNA polymeraseⅡsubunit 2, POLR2B)、丙酮酸脱氢酶E1α亚单位基因(pyruvate dehydrogenase (lipoamide) alpha 1, PDHA1)、Janus激酶1(Janus kinase 1, JAK1)的表达差异进行了验证,得出HOXA4.CCR8.CPO分别上调2.56、32.94和30.96倍,POLR2B、PDHA1为无变化的0.87和0.76倍,JAK1则下调0.48倍。而Human Genome U133 plus表达谱芯片筛出的这几个差异表达基因分别为7.297、7.775、10.52、1、1和0.477倍,与Realtime PCR的结果基本保持一致。 2.人工感染SS2的猪脑组织、肺组织及外周血单核淋巴细胞的表达谱变化 用SS2感染仔猪,24小时后宰杀,取得对照组和实验组仔猪的脑组织、肺组织及全血分离获得的PBMC。提取总RNA,反转录成cDNA,然后在体外(IVT)合成cRNA,将cRNA片段化后与Affymetrix GenChip@系列的Porcine Genome基因芯片进行杂交,通过洗片、扫描得到表达谱芯片的各探针的信号值,通过分析得到感染了SS2的猪的脑、肺及PBMC,相比较没感染SS2的脑、肺及PBMC,基因的表达量是否发生了变化,以及变化的倍数(Fold Change,FC)。本实验以p-value小于或等于0.05且FC大于或等于2的基因为上调,p-value小于或等于0.05且FC小于或等于-2的基因为下调。经过统计学分析,在此芯片中包含的20201个猪的基因中,脑组织中总共检测到1608个有显著性差异表达变化的基因,包含了344个上调和1264个下调。肺组织中检测到617个有显著性差异表达变化的基因,包括293个上调和324个下调。PBMC中共检测到685个有显著性差异表达变化的基因,包括403个上调和282个下调。在3个组织中均有有显著性差异表达变化的基因有31个,包括了26个上调基因和5个下调基因。 利用DAVID (Visualization and Integrated Discovery)在线软件分析,共检测到脑中417个已知的基因。在肺中共检测到210个已知的基因,在PBMC中检测到213个已知的基因。将这些检测到的基因进行分类,可以知道差异表达基因主要集中在以下几个类别,包括:防御反应(defence response)、免疫反应(immune response)、炎症反应(inflammatory response)、天然免疫(innate immune response)、细胞粘附(cell adhesion)、细胞死亡(cell death)、细胞分化(cell differentiation)、与信号传导关联的细胞表面受体(cell surface receptor linked signal transduction)、细胞因子活性(cytokine activity)、细胞因子结合(cytokine binding)、对外界刺激的反应(response to external stimuli)、对刺激的反应(response to stimulus)、应激反应(response to stress)、创伤反应(response to wounding)、信号转导活性(signal transducer activity)、基因表达(gene expression)和生长因子活性(growth factor activity)。 进一步用实时荧光定量PCR方法对其中5个相关基因:ICAM-1、TLR2、CD163、TTR、VEGFA的表达差异进行了验证。得到结果ICAM-1、TLR2、CD163在脑中上调表达6.00、19.89、179.61倍,TTR和VEGFA下调-10.92和-4.205倍,而Porcine Genome表达谱芯片筛出的这几个差异表达基因分别为5.77、3.86、8.91、-12.83和1.55倍。在肺中,上调基因ICAM-1、TLR2、CD163的表达分别为55.50、25.59和11.30倍,TTR和VEGFA下调-7.69和-3.45倍,而表达谱芯片筛出的这几个摧因分别为1.97、2.44、4.25、-1.05和-2.22倍。在PBMC中,ICAM-1、TLR2、CD163的表达量分别为上调了13.13、8.57、3.39倍,TTR和VEGFA无明显变化为-0.69和-1.27倍,而表达谱芯片筛出的这几个基因分别为3.16、2.70、9.08、-1.07、-2.71倍。与基因芯片的结果相比较,两种方法检测到的基因的表达趋势基本一致。肺中检测到的ICAM-1和TTR,以及脑中的VEGFA的表达数量与基因芯片所得的结果有一些差异,但变化趋势相同,表明芯片的结果可信。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S852.611

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