四个月季品种体细胞胚诱导及遗传转化的研究

【摘要】：月季(Rosa hybrida)是蔷薇科蔷薇属的半常绿木本植物,是世界上栽培历史最久、最受人们钟爱的观赏花卉之一,因其花色艳丽、香味浓郁,被誉为中国传统十大名花之一,切花月季同时又是世界重要切花之一,具有很高的观赏价值和商业价值。本试验对四个现代月季切花品种的快速繁殖体系进行了建立,并以未展开复叶片为外植体,建立了体细胞胚发生途径及再生体系。同时利用体细胞胚再生体系进行了遗传转化的初步研究。其主要研究结果如下： 1.月季快速繁殖体系的建立 以现代月季品种‘卡罗拉’为试材,对其组培过程中消毒、初代培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽等各个环节进行了研究。研究结果表明：消毒时去掉叶柄降低了污染率,且腋芽萌发良好；增殖培养基以MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶的效果最好,长势健壮,不定芽增殖系数达到3.41；最适宜的生根培养基是1/2MS+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶,平均根长在2.52cm,根系发达,根的生长状态最佳。在移栽试验中,经过6天炼苗处理,成活率达到94.44%。 2.月季体细胞胚发生途径及再生体系的建立 以四个现代月季切花品种‘卡罗拉’、‘黑魔术’、‘假日公主’、‘莫尼卡’的未展开复叶片为外植体,通过直接途径和间接途径对体细胞胚诱导及再生等条件进行了研究。结果表明：基因型、外植体类型、不同激素种类及浓度组合、培养条件对体细胞胚诱导和植株再生都产生着重要影响。四个月季品种的组培苗未展开复叶片和露地中的未展开复叶片都没有通过直接发生途径得到体细胞胚。以组培苗的未展开复叶片为外植体通过间接发生途径,只有‘卡罗拉’有体细胞胚发生,其他三个月季品种均没有得到体细胞胚。‘卡罗拉’体细胞胚的诱导率在不同的培养基上存在显著差异,在MS+2.0mg/L ZT+0.1mg/L NAA+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝胶的培养基上诱导率最高,达到13.33%。‘卡罗拉’体细胞胚在MS+1.5mg/L ZT+0.2mg/L NAA+0.1mg/L GA3+60g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝胶的培养基上生长旺盛,光泽度好,增殖系数为4.02,体细胞胚组织比例达到90%以上,有次生胚长出,增殖效果最好。‘卡罗拉’体细胞胚在MS+1.0mg/L6-BA+0.01mg/L IBA+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝胶的培养基上体细胞胚萌发率最高,达到43.33%,单位体细胞胚成苗数是1.31。 此外,‘卡罗拉’组培苗在生根试验中,光照条件培养于1/2MS+1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶的培养基上,8周之后发现在根轴部位通过直接发生途径长出子叶状体细胞胚。然后置于体细胞胚增殖培养基：MS+1.5mg/L ZT+0.2mg/L NAA+0.1mg/L GA3+60g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝胶培养,增殖效果显著。 3.以体细胞胚为转化受体的月季遗传转化的研究 以‘卡罗拉’体细胞胚作为农杆菌介导遗传转化的转化受体,利用上述优化了的体细胞胚再生体系,通过对共培养后GUS基因瞬间表达率的分析,对其遗传转化进行了初步研究。其研究结果表明：侵染40min,共培养3d,80mg/L Km和300mg/LCef的条件下,GUS瞬间表达率极低。在萌发培养基MS+1.0mg/L6-BA+0.01mg/LIBA+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝胶+300mg/L Cef+80mg/L Km上体细胞胚生长状态极差,变褐死亡,未得到再生的植株。