马铃薯晚疫病抗性相关胞质类受体蛋白激酶基因StPK1的功能研究

【摘要】：晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害。晚疫病抗性分为垂直抗性和水平抗性,垂直抗性由主效基因控制,具有小种转化性,抗性常因晚疫病菌生理小种变异而迅速丧失。水平抗性是由微效多基因控制的,对马铃薯晚疫病具有广谱性,稳定性的特点。因此,选育广谱,稳定的水平抗性品种已成为马铃薯晚疫病抗病育种的重要目标。本实验窒前期从马铃薯晚疫病水平抗性相关的ESTS中克隆出一个可以调控马铃薯晚疫病抗性的胞质类受体激酶基因StPK1。植物激酶是一类重要的蛋白激酶,它们在抗病性,抗逆和生长发育等方面都具有重要作用。前期研究表明,StPK1基因可被马铃薯晚疫病诱导表达,但其功能有待进一步试验证实。同时,StPK1蛋白是否具有激酶活性亦为探讨该基因的作用机理所必须。本课题通过基因StPK1转基因株系的抗病性鉴定、蛋白激酶原核表达及激酶活性测定等研究,探讨基因stPK1在抗晚疫病中的作用机理。主要结果如下： 1.利用Realtime-PCR筛选己获得的StPK1超量转基因株系和干涉转基因株系,其中StPK1干涉株系干涉效率最高为70%,超量表达株系表达量最高为对照E3的600倍。后续晚疫病抗性鉴定选用了以上5株超量表达和4株干涉表达效果好的转基因株系进行晚疫病接种实验。统计病斑面积结果,超量表达株系病斑扩展速率显著小于对照(E3)病斑扩展速率,干涉株系的病斑扩展速率显著大于对照(E3)病斑扩展速率,表明StPK1基因参与了马铃薯晚疫病抗病性反应。 2.构建了StPKl的绿色荧光表达载体GFP-StPK1,转化大肠杆菌,抽提质粒后,用基因枪轰击法转化洋葱表皮细胞,暗培养12小时后,激光共聚焦显微镜观察。发现,GFP-StPK1绿色荧光主要出现在细胞质中,说明蛋白激酶StPK1是在马铃薯细胞质内行使功能。 3.构建了StPK1基因的原核表达载体,转化大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白体外表达。GST柱式透析纯化蛋白质,用同位素标记的γ-32P-ATP测定蛋白激酶的磷酸化活性。结果表明,蛋白激酶StPK1与ATP发生反应,有较强的自磷酸化活性,是一个有活性的蛋白激酶。蛋白激酶stPK1磷酸化活性的证实,为寻找其磷酸化互做底物及深入探讨其抗病性的作用机理奠定基础。