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《华中农业大学》 2012年
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EHEC O157:H7的IMS-PCR检测方法的研究

王倩  
【摘要】:肠道出血性大肠杆菌(EHEC)是一类能够引起人类出血性结肠炎或溶血性尿毒综合征的致病性大肠杆菌。0157:H7是EHEC最具代表性的血清型,其污染食品被人类食入后可导致感染,是一种重要的食源性致病菌。EHEC O157:H7感染剂量很低,增加了疾病的危险性,而且它在食品中的污染量很低,因此对0157:H7的检测常常需要对食品样本中的细菌进行前增菌。在进行选择性平板计数前,可以用增菌液对样品进行增菌18h,或者利用免疫磁性分离技术来富集0157。本研究利用杂交瘤技术,制备EHEC O157:H7单克隆抗体,包被在磁珠表面制备成免疫磁珠,富集细菌后用二重PCR方法进行检测,以建立一种快速、准确而灵敏的EHEC O157:H7检测方法。 1.EHEC O157:H7菌体抗原单克隆抗体的制备及鉴定 以EHEC O157:H7菌体抗原为免疫原,免疫BALB/c小鼠,获得8株分泌EHEC0157:H7菌体抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H1、1H3、2A2、3C5、4B10、4E4、4H10、6F4。在这8个细胞株中,1H1、1H3、2A2、3C5、4H10属于IgG2b亚类,4B10、4E4则属于IgG2c亚类,而6F4则为IgM。8株单抗的腹水效价均在1×105以上。间接ELISA鉴定单抗的特异性,结果1H1、1H3、A2、3C5、4H10、6F4均不与其他7种菌株(E.coli O138:K81,K88ac、E.coli K12:K99、E.coli O11、E.coli0109、单核细胞增生李斯特菌标准菌株CCTCCAB97021、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌ATCC25923)发生交叉反应,而4B10、4E4除了不与单核细胞增生李斯特菌标准菌株CCTCCAB97021发生反应,与其它6种菌株有不同程度的交叉反应。 2.免疫磁珠的制备 将2A2单克隆抗体固定在表面包被有蛋白A的磁珠(Dynabeads (?) Protein A)上,制备出免疫磁珠。 3. IMS-PCR方法的建立 分别针对EHEC O157:H7的菌体抗原和鞭毛抗原设计2对引物,用免疫磁珠富集EHEC O157:H7,建立IMS-PCR检测方法。利用IMS-PCR对8种菌株(E.coli O138:K81,K88ac、E.coli K12:K99、E.coliO11、E.coli0109、E.coli O139、金黄色葡萄球菌ATCC25923、单核细胞增生李斯特菌标准菌株CCTCCAB97021、鼠伤寒沙门菌)进行检测,未扩增出目的条带,表明IMS-PCR特异性很好;增菌6h时,IMS-PCR灵敏度为1.1×101cfu/mL。用纯牛奶进行人工污染实验,同时用PCR和IMS-PCR方法进行检测,结果增菌4.5h时,PCR检测方法的灵敏度达到2.5×101cfu/mL;增菌4h时,IMS-PCR检测方法的灵敏度能达到2.5×100cfu/mL。
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S852.61

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