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《华中农业大学》 2012年
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毛木耳油疤病病原物分离鉴定及其致病性分析

孙婕  
【摘要】:毛木耳(Auricularia polytricha)是一种重要的人工栽培食用菌,在我国福建、四川、河南、湖北、江苏等地广泛采用规模化袋式栽培。2009年我们在四川省发现一种被称为毛木耳“油疤病”的病害。油疤病的发生为毛木耳产业带来了严重的经济损失。 本文调查了毛木耳油疤病的发生发展规律,进行病原物的分离和鉴定,依据柯赫氏法则验证了病原物的致病性,并对其中的三个致病因子进行了初步分析。 通过常规的组织分离方法从油疤病发病菌袋中分离到一种真菌性分离物,对该真菌进行了培养特性、显微特性观察以及ITS、18S分子序列分析,确定分离到的真菌为木栖柱孢霉(Scytalidium lignicola),国内未见此真菌引起食用菌病害的报道。 利用两种方法验证分离到的木栖柱孢霉的致病性,一种是在菌袋培养料两端同时分别接种毛木耳菌丝和木栖柱孢霉菌丝,另一种是在长满毛木耳菌丝的菌袋上接种木栖柱孢霉菌丝。两种方法接种后的毛木耳菌袋中均产生了与田间调查相同的症状。对发病部位进行再分离,获得的再分离物的培养特性及ITS序列和木栖柱孢霉相同。表明该分离物为油疤病的致病菌。 从三个方面分析病原菌的致病因子,分别是胞外酶、毒素和黑色素。 木栖柱孢霉菌丝体在液体摇床培养条件下,可以检测到果胶酶、葡聚糖内切酶酶(Cellulose-Cx)和蛋白酶(Protease-Pro)。果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase-PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(Pectin methyl galacturonic acid enzymes-PMG)、果胶甲基酯酶(Pectin methyl esterase-PME)、果胶甲基反式消除酶(Pectin methyl TRANS-elimination enzymes-PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(Poly galacturonic acid TRANS-elimination enzymes-PGTE)。其中PME活性最高,可高达44.61U/mg,即病原菌的菌丝体从果胶质中除去甲基,产生果胶酸的能力较强;而PG和PMG的活性较低,即病原菌菌丝体水解果胶质的能力较弱;PGTE、PMTE活性不稳定,病原菌菌丝体裂解果胶和果胶酸的能力不均衡,没有规律性;Cx从培养第四天开始就保持较高的活性,病原菌菌丝体葡聚糖内切酶的活性高,对葡聚糖的分解能力较强;Pro的活性在培养的后期维持在较高的水平,此时病原菌菌丝体分解蛋白质的能力较强。 采用三种方法进行毒素的提取工作,并利用透析袋、高压灭菌处理和SDS-PAGE分析验证提取到的毒素的性质。提取的毒素滤液、透析后的毒素滤液均对毛木耳菌丝产生致病性,影响毛木耳菌丝的生长,使之出现变黄、萎蔫等的症状,而高压灭菌处理的毒素滤液对毛木耳菌丝无影响。毒素滤液的SDS-PAGE分析没有出现蛋白条带,推测提取到的毒素为多糖类物质。 利用酸沉淀法提取木栖柱孢霉的黑色素,提取率较高。对黑色素进行溶解性、热稳定性、光稳定性和抗氧化性等分析,发现该色素溶于碱,微溶于水,不溶于酸和常规有机试剂,热稳定性和光稳定性好,抗氧化性低。对色素进行紫外光谱、红外扫描、核磁共振和三环唑抑制等分析,从分析结果推测木栖柱孢霉产生的黑色素含有羧基、芳环、酚羟基和吲哚环等官能团,可能为DHN黑色素。 三个因子相互影响,交互作用,共同通过影响毛木耳细胞的超微结构从而破坏其生理功能。关于各个因子的具体致病机制目前还不清晰,需做进一步的研究确定。
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