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骨骼肌发育中miR-148a功能与qPCR内参基因的研究

张晶  
【摘要】:本文围绕骨骼肌发育这一主题集中探讨了两个问题:miR-148a在骨骼肌发育中的作用及其作用机理;不同发育时期猪骨骼肌基因表达分析技术qPCR中内参基因的选择。主要工作及结果如下: 1.骨骼肌发育中miR-148a的功能研究 MicroRNA (miRNA)是一类进化上保守的非编码小分子RNA。这类小RNA通过降解靶基因mRNA或者阻滞蛋白质翻译,调控基因的表达。它们在早期发育、细胞增殖、分化和凋亡等一系列生物学过程中发挥着极其重要的作用。 在前期应用深度测序技术(Deep Sequencing Approach)筛选出一系列在猪的胚胎和成年骨骼肌不同发育时期差异表达的miRNAs的研究工作中,我们发现miR-148a在胚胎时期的骨骼肌组织中高表达,但在成年猪的骨骼肌中几乎不表达。目前已经报道miR-148a与癌症相关,但它在骨骼肌发育中的功能迄今还未见报道。 在本研究中,我们从多个方面探讨了miR-148a在骨骼肌发育中的功能。我们发现并证实miR-148a能促进成肌细胞分化并一定程度阻滞细胞周期,以及miR-148a是通过抑制RhoA/ROCK信号通路中ROCK1的表达,从而实现对肌肉分化的正向调控。 (1)我们首先建立了C2C12细胞体外分化模型,通过对miR-148a在分化第0天、1天、3天和5天表达的定量检测,发现miR-148a随着C2C12分化上调表达。 (2)通过对过表达miR-148a后的C2C12细胞进行全基因组表达谱芯片分析,发现miR-148a过表达促进了一系列肌肉特异性基因的上调,并利用qPCR检测了6个上调表达的肌特异性基因(Tnnt3、Mb、Mylpy、Myom3、myogenin和IGF2)的表达,验证了芯片检测结果。 (3)诱导过表达或抑制miR-148a后C2C12和骨骼肌原代细胞分化,并检测分化标志基因MHC、myogenin和Skeletal a-actin在mRNA和蛋白水平上的表达变化。结果表明:过表达miR-148a后分化标志基因上调,反之抑制miR-148a后分化标志基因下调,因此证明miR-148a能够促进成肌细胞分化,具有正向调控肌肉分化的功能。 (4)应用CCK-8细胞增殖检测方法分析miR-148a对C2C12细胞增殖的作用,结果表明过表达或抑制miR-148a对细胞增殖没有影响;应用流式细胞术分析miR-148a对C2C12细胞周期的影响,在C2C12中过表达miR-148a,发现miR-148a实验组中处于G1期的细胞比例显著高于对照组(P0.05),而处于S期的细胞比例显著低于对照组,说明miR-148a加强了G0/G1期的细胞阻滞,有利于肌细胞分化。 (5)在探明miR-148a促进成肌细胞分化后,我们应用TargetScan和miRanda软件对miR-148a的靶标基因进行预测,筛选出候选靶标ROCK1基因(一种分化抑制基因)。通过双荧光素酶报告基因实验确定了ROCK1的3'UTR(非翻译区)含有miR-148a的作用靶位点,同时运用qPCR和western blot验证了miR-148a抑制ROCK1的蛋白翻译,而不影响其转录。 (6)运用siRNA干扰C2C12和骨骼肌原代细胞内源性ROCK1后,其表达受到抑制,而分化标志基因的表达上调,这一结果说明ROCK1是分化抑制基因,而且干扰ROCK1表达可促进肌细胞分化。 2.骨骼肌基因表达分析qPCR中内参基因的选择 在基因表达分析,如定量PCR (quantitative polymerase chain reaction, qPCR)中,通常用内参基因(reference gene)来校正目标基因的表达量。理想的内参基因应在各种实验因素条件下都恒定表达。但大量的研究结果证明,在不同组织、不同发育阶段和不同实验条件下,内参基因的表达都存在不同程度的变化。因此,在基因表达转录分析qPCR中,选择合适的内参基因用于目标基因表达量的校正,是得到准确可靠数据的关键。 本研究主要探讨了猪不同组织和不同发育时期骨骼肌基因表达qPCR分析中内参基因的选择。我们首先应用qPCR技术检测6个候选内参基因(GAPDH、ACTB、 H3F3A、HPRT1、RPL32和RPS18),在通城猪和长白猪不同组织和不同胚胎时期骨骼肌(胚胎期第33天、65天和90天)中的表达量。通过运用NormFinder、BestKeeper和geNorm三种软件评价这些候选内参基因的表达稳定性。我们的结果表明,这6个候选基因在不同猪种、不同组织和不同发育阶段的骨骼肌中都存在表达的不稳定性,但其中表达较为稳定的基因是RPS18、PRL32和H3F3A。 本研究同时探讨了以上3个内参基因的组合。结果表明:在通城猪骨骼肌不同发育时期的基因表达分析中,H3F3A和RPS18是最合适的内参基因组合;在长白猪骨骼肌不同发育时期的基因表达分析中,PRL32和RPS18是最合适的内参基因组合;在通城猪和长白猪的不同组织中,PRL32和RPS18表达相对稳定,再联合H3F3A一起可作为较合适的内参基因组合。因此,本研究为猪的基因表达转录分析qPCR提供了几组较为可靠的内参基因组合方案,可用来比较准确地校正目标基因的表达量。


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